一种构建奥利万星前体高产工程菌的方法及应用技术

本发明专利技术提供一种构建奥利万星前体高产工程菌的方法及应用，所述奥利万星前体高产菌为Chloroeremomycin，将奥利万星前体生物合成的正调控基因strR导入产Chloroeremomycin的东方拟无枝酸菌中，从而获得奥利万星前体Chloroeremomycin的高产菌，保藏号CGMCC NO.21140。本发明专利技术方法避免了传统诱变育种技术手段带来的周期长，耗费人力物力的缺点。产量比出发菌提高了40％，达140mg/L，降低了奥利万星前体的生成成本，可提高奥利万星前体Chloroeremomycin的生物合成，在奥利万星前体工业化生产中有重要的应用价值，为开发糖肽类抗生素提供有效的技术手段。抗生素提供有效的技术手段。

【技术实现步骤摘要】
一种构建奥利万星前体高产工程菌的方法及应用


[0001]本专利技术属于药物生物
，涉及一种构建奥利万星高产工程菌的方法及其应用。

技术介绍

[0002]万古霉素是治疗耐药革兰氏阳性菌感染的重要糖肽类抗生素，但革兰氏阳性致病细菌耐药性问题日趋严重，世界各地相继出现了万古霉素耐药金黄色葡萄球菌(VISA、VRSA)以及万古霉素耐药肠球菌(VRE)。因此，万古霉素已不能完全满足临床需要，有必要开发新一代糖肽类抗生素药物。
[0003]2014年，美国FDA批准Medicines公司开发的奥利万星(Oritavancin)上市，商品名为Orbactiv，它是万古霉素后的新一代糖肽类抗生素。奥利万星是美国FDA批准用于治疗急性细菌性皮肤和皮肤结构感染(ABSSSIs)的首个和唯一的单剂量治疗方案的抗生素。奥利万星注射剂用于治疗革兰阳性细菌导致的ABSSSIs成人感染。
[0004]东方拟无枝酸菌是奥利万星前体Chloroeremomycin(又名A82846B)的生产菌，目前发酵单位较低。因此利用合成生物技术理性重构其合成途径以提高Chloroeremomycin的发酵水平，对奥利万星产业化具有重要的应用价值。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种奥利万星前体高产工程菌的构建方法，所述奥利万星前体高产菌为Chloroeremomycin，取保藏号为ACCC40175的东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)，经实验室遗传育种后成为Chloroeremomycin产生菌，将奥利万星前体Chloroeremomycin生物合成的正调控基因strR导入，从而获得Chloroeremomycin高产菌，获得的Chloroeremomycin产量提高约40％，达140mg/L。该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为：东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)L80，保藏号：CGMCC NO.21140，保藏日：2020.11.9。
[0006]本专利技术构建方法具体步骤如下：
[0007](1)购置特异性引物以东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)，保藏编号为ACCC40175，分类命名:东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis),基因组为模板扩增SEQ ID NO.1序列并回收：
[0008]上游引物SEQ ID NO.3：aaaggaggcggacatcatatggtggatccgacgagagtagacc下游引物SEQ ID NO.4：catgattacgaattcgatatcttacgcgatcgctcccgtgg
[0009](2)步骤(1)中回收的片段插入表达载体psoK804上得到质粒psoK804-ermE*-strR，并验证；
[0010](3)步骤(2)中获得的质粒通过化转导入大肠杆菌E.coil ET12567/pUZ8002中；
[0011](4)通过接合转导将步骤(2)中的质粒转入Chloroeremomycin产生菌东方拟无枝酸菌中；
[0012](5)通过发酵并高效液相色谱检测，原始菌Chloroeremomycin产量提高约40％，达140mg/L。
[0013]上述方法中，步骤(1)将SEQ ID NO.1的序列插入质粒pSOK804，得到重组质粒pSOK804-ermE*-strR。根据步骤(1)所述的SEQ IDNO.1由975个核苷酸组成，SEQ ID NO.2为Chloroeremomycin生物合成正调控基因的氨基酸序列。
[0014]上述方法中，步骤(2)中将所述的表达载体pSOK804经过NdeI-EcoRV双酶切后插入SEQ ID NO.1序列，启动子为含红霉素抗性基因启动子erme*p；
[0015]上述方法中，步骤(3)将质粒pSOK804-ermE*-strR通过热击导入大肠杆菌E.coil ET12567/pUZ8002中；利用接合转移导入Chloroeremomycin产生菌东方拟无枝酸菌，从而获得高产奥利万星前体Chloroeremomycin的菌。
[0016]通过发酵并高效液相色谱检测，通过接合转导得到的基因工程菌较野生型菌Chloroeremomycin产量提高约40％，达140mg/L。
[0017]本专利技术的另一个目的是提供所述方法在高产奥利万星前体Chloroeremomycin工程菌中的应用。所产Chloroeremomycin菌产量提高约40％，达140mg/L。
[0018]本专利技术所述的高产奥利万星前体Chloroeremomycin菌构建方法，可以使奥利万星前体Chloroeremomycin的发酵水平比出发菌提高约40％，达140mg/L，具有很好的产业应用价值。
[0019]本专利技术的优点是：(1)本专利技术基于基因工程手段通过导入奥利万星前体Chloroeremomycin生物合成正调控基因，获得奥利万星前体Chloroeremomycin的高产菌，目标明确，避免了传统诱变育种的技术手段带来的周期长，耗费人力物力的缺点。
[0020](2)本专利技术所构建的高产奥利万星前体Chloroeremomycin基因工程菌产量比出发菌提高了40％，达140mg/L，大大降低了奥利万星前体Chloroeremomycin的生成成本，在奥利万星前体Chloroeremomycin工业化生产中有重要的应用价值。
[0021]本专利技术通过基因工程手段构建Chloroeremomycin高产菌，可以提高奥利万星前体Chloroeremomycin的生物合成，该方法为开发糖肽类抗生素提供了有效的技术手段。
附图说明
[0022]图1是表达质粒psok804-erme*-strR图谱。
[0023]图2图2产Chloroeremomycin出发菌和基因重组后的东方拟无枝酸菌基因工程菌CGMCC NO.21140 Chloroeremomycin发酵产量随时间的变化。
具体实施方式
[0024]本专利技术结合附图和实施例作进一步的说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0025]实施例中所使用的培养基：YMG固体培养基：酵母提取物4.0g、麦芽提取物10.0g、葡萄糖4.0g、琼脂20.0g、蒸馏水1000ml，pH 7.3。
[0026]LB液体培养基：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10g,琼脂20.0g、蒸馏水
1000ml，pH 7.3。
[0027]2×
YT液体培养基：蛋白胨16.0g，酵母提取物10.0g，NaCl5g,琼脂20.0g、蒸馏水1000ml，pH 7.3。
[0028]MS固体培养基：甘露醇20g，黄豆粉20g本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建奥利万星前体高产工程菌的方法，其特征在于所述奥利万星前体高产菌为Chloroeremomycin，取保藏号为ACCC40175的东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)，经实验室遗传育种后成为Chloroeremomycin产生菌，将奥利万星前体Chloroeremomycin生物合成的正调控基因strR导入，从而获得Chloroeremomycin高产菌，获得的Chloroeremomycin产量提高约40％，达140mg/L。该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为：东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)L80，保藏号：CGMCC NO.21140，保藏日：2020.11.9。2.根据权利要求1所述的一种构建奥利万星前体高产工程菌的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)设计特异性引物以东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)基因组为模板扩增SEQ ID NO.1序列并回收：上游引物SEQ ID NO.3：aaaggaggcggacatcatatggtggatccgacgagagtagacc，下游引物SEQ ID NO.4：catgattacgaattcgatatcttacgcgatcgctcccgtgg；(2)步骤(1)中回收的片段插入表达载体psoK804上得到质粒psoK804-ermE*-strR，并验证；(3)步骤(2)中获得的质粒通过化转导入大肠杆菌E.coil ET12567/pUZ8002中...

【专利技术属性】
技术研发人员：李永泉，钱辉，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：