构建于大肠杆菌中的粪肠球菌群体感应基因开关系统及其表达载体、工程菌和应用技术方案

本发明专利技术公开了一种构建于大肠杆菌中的粪肠球菌群体感应基因开关系统及其表达载体、工程菌和应用，该系统包括粪肠球菌的七肽信息素cCF10基因ccfa，负调控信息素肽基因prgx和启动子序列Pprgq。本发明专利技术基因开关系统是一种不依赖诱导剂，可以自发动态调节靶基因表达的基因开关系统，并利用该系统构建可以在OD

【技术实现步骤摘要】
构建于大肠杆菌中的粪肠球菌群体感应基因开关系统及其表达载体、工程菌和应用


[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种构建于大肠杆菌中的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)群体感应基因开关系统及其表达载体、工程菌和应用。

技术介绍

[0002]发酵工程菌需要合成大量重组蛋白，搭建合成通路，如果在培养起点就开始大量表达重组蛋白会和细胞代谢竞争胞内资源，给菌体带来巨大的负担，代谢网络失衡会导致一些有毒的中间产物的积累，也会对菌体生长造成毒害，使菌株无法保持良好的生长状态，影响最终产物的产量。因此前人探索了多种操纵元件，实现对基因的诱导调控，包括：色氨酸操纵子、阿拉伯糖操纵子以及许多杂合操纵子等，其中以受IPTG诱导的乳糖操纵子应用最为广泛。诱导型启动子有许多优点，包括能通过调节诱导剂浓度调节基因表达强度、通过控制诱导剂添加时间控制基因表达的启动时间以平衡菌体的生长和产物的合成等。但是诱导型启动子也存在许多问题，包括无法实现靶基因的动态调控、对细胞状态无法及时反馈等。另外，诱导剂昂贵的价格阻碍了其在大规模工业化生产中的应用。
[0003]解决这一问题的方法之一就是在发酵菌株内引入动态的基因开关来控制途径基因的表达，目前已经有许多这方面的尝试。但是这些策略需要响应于特定的中间产物、细胞状态或者培养基组成，缺乏普适性，无法应对复杂多变的产物需求。而群体感应(Quorum sensing)系统作为细胞密度的监控感应系统同时具有动态调节和通用性的优点。因此，基于群体感应的动态调节系统具有很高的研究价值以及应用前景。
[0004]粪肠球菌(Enterococcus faecalis)是一种常见的病原菌，使人患尿路感染、腹膜炎和心内膜炎等疾病，也可引起动物疾病，包括公猪睾丸炎、羊羔脑炎和雏鹅败血症等，粪肠球菌属于革兰氏阳性，通过氨基酸和短肽类物质(AIPs)介导的群体感应系统调控其生命活动过程。近年来，针对分泌到胞外的特异性信号肽分子的生成，信号肽分子的蓄积过程，信号肽分子的最大浓度等方面实施有效地干扰抑制成为研究热点，但是利用粪肠球菌群体感应系统可以检测细胞浓度的特性在常见工程菌如大肠杆菌中构建基因开关的应用尚未见报道。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种构建于大肠杆菌中的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)群体感应基因开关系统，该基因开关系统是一种不依赖诱导剂，可以自发动态调节靶基因表达的基因开关系统，并利用该系统构建可以在合适的OD
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状态下启动靶基因表达的大肠杆菌。
[0006]本专利技术还提供了所述粪肠球菌群体感应基因开关系统的表达载体、工程菌及其应用。
[0007]本专利技术通过将基因元件分别构建到不同的表达载体上，本专利技术在工程菌(以大肠
杆菌为宿主)内部构建了一个基因开关，具有自发动态调节发酵菌株代谢流，控制基因表达的功能，可以避免诱导剂的添加，节约发酵成本，简化发酵流程。
[0008]技术方案：本专利技术所述一种构建于大肠杆菌中的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)群体感应基因开关系统，该系统元件包括粪肠球菌的七肽信息素cCF10基因ccfa，负调控信息素肽基因prgx和可以感应负调控信息素肽的启动子序列Pprgq。
[0009]具体包括粪肠球菌的负调控信息素肽基因prgx，与负调控信息素肽竞争结合的七肽信息素cCF10的基因ccfa和可以感应负调控信息素肽的启动子序列Pprgq其核苷酸序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5所示。
[0010]其中，所述Pprgq是强组成型启动子，可以组成型表达启动子下游基因。
[0011]进一步地，所述负调控信息素肽会与组成型启动子Pprgq结合，抑制启动子下游基因的表达。
[0012]作为优选，所述七肽信息素基因ccfa和负调控信息素肽基因prgx组成型转录翻译合成对应的七肽信息素和负调控信息素肽，当环境中的七肽信息素积累到一定浓度后，即可以和负调控信息素肽结合的浓度后抑制负调控信息素肽对启动子的抑制作用，或者说一般达到绿色荧光表达出来的浓度即可，逐渐启动Pprgq下游基因的表达。
[0013]作为优选，所述基因ccfa、prgx、Pprgq可以转录翻译合成七肽信息素和负调控信息素肽并调节靶基因表达。
[0014]本专利技术所述的表达载体，其包含所述的基于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)群体感应系统的基因开关系统。
[0015]作为优选，本专利技术基于粪肠球菌群体感应基因开关系统的表达载体包括由Pprgq、prgx、ccfa形成的载体C-Pprgq-egfp，A-trc(lost operon)-prgx和E-trc(lostoperon)-ccfa。
[0016]作为优选，所述的表达载体将粪肠球菌(Enterococcus faecalis)群体感应基因开关系统构建到表达载体上便于在微生物体内复制以及表达。
[0017]作为优选，所述的表达载体的构建步骤为将Pprgq启动子连接到pCDFDuet-1，再连接绿色荧光蛋白基因egfp连接，得到pCDF-Pprgq-egfp；将trp和lac的杂合启动子trc(zu)除去lacO操纵子，得到组成型启动子trc(lost operon)，将双酶切的trc(lost operon)连接到pACYCDuet-1和pETDuet-1的EcoNI和XhoI处，并在XhoI前加上NcoI/EcoRI等酶切位点，得到pACYC-trc(lost operon)和pET-trc(lost operon)，将双酶切prgx和ccfa分别连接到pACYC-trc(lost operon)和pET-trc(lost operon)的NcoI/EcoRI处，得到A-trc(lost operon)-prgx和E-trc(lost operon)-ccfa。
[0018]本专利技术所述的基因工程菌，以大肠杆菌为宿主，其包含所述的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)群体感应基因开关系统或者所述的表达载体。
[0019]作为优选，所述粪肠球菌群体感应基因开关系统的基因工程菌主要是将表达载体C-Pprgq-egfp，A-trc(lost operon)-prgx和E-trc(lost operon)-ccfa一起导入基因工程菌内。
[0020]进一步地，其中，所述的基因工程菌可以利用所述的基于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)群体感应基因开关系统，实现绿色荧光蛋白及丙二酰辅酶A合成途径表达的动态调控。
[0021]本专利技术所述的基于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)群体感应系统的基因开关系统在实时调节发酵菌株代谢流，控制基因表达的功能中的应用。
[0022]其中，所述基因开关系统在以导入基因开关系统的工程菌为发酵菌株本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种构建于大肠杆菌中的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)群体感应基因开关系统，其特征在于，该系统元件包括粪肠球菌的七肽信息素cCF10基因ccfa，负调控信息素肽基因prgx和可以感应负调控信息素肽的启动子序列Pprgq。2.根据权利要求1所述的构建于大肠杆菌中的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)群体感应基因开关系统，其特征在于，所述Pprgq是强组成型启动子，可以组成型表达启动子下游基因。3.根据权利要求2所述的构建于大肠杆菌中的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)群体感应基因开关系统，其特征在于，所述负调控信息素肽会与组成型启动子Pprgq结合，抑制启动子下游基因的表达。4.根据权利要求1所述的在构建于大肠杆菌中的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)群体感应基因开关系统，其特征在于，所述七肽信息素基因ccfa和负调控信息素肽基因prgx组成型转录翻译合成对应的七肽信息素和负调控信息素肽，当环境中的七肽信息素积累到可以和负调控信息素肽结合的浓度后抑制负调控信息素肽对启动子的抑制作用，逐渐启动Pprgq下游基因的表达。5.一种表达载体，其特征在于，包含权利要求1所述的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)群体感应基因开关系统。6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体将基于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)群体感应基因开关系统构建到表达载体上便于在微生物体内复制以及表达。7.根据权利要求5所述的表达载体，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴俊俊，周朋，包美娇，董明盛，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：