本发明专利技术提供了在真核细胞中获得位点特异性重组的方法，所述方法包括：提供包含第一重组附着位点和第二重组附着位点的真核细胞；将所述第一和第二重组附着位点与原核重组酶多肽接触，导致在所述重组附着位点之间产生重组，其中重组酶多肽能够介导第一和第二重组附着位点之间的重组。本发明专利技术也描述了用于产生转基因细胞、组织、植物和动物的组合物、载体和其使用方法。本发明专利技术的组合物、载体和方法也可用于基因治疗用途。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域。具体而言，本专利技术涉及用于在细胞基因组中进行多核 苷酸的位点特异性整合、删除、倒位、交换和易位的组合物和方法。本专利技术也涉及酶、多核苷酸、多肽和载体构建物。
技术介绍
许多噬菌体和整合型质粒编码位点特异性重组系统，这使得能够将它们的基因组稳定地整合入它们宿主的基因组中，并将它们的基因组从宿主基因组切除。在这些系统中，对于重组反应的最小要求是重组酶和两个重组位点，其中重组酶催化重组事件(Sadowski(1986)J. Bacteriol. 165:341-347 ；Sadowski(1993)FASEB J.7:760-767)。对于噬菌体整合系统而言，这些是指附着(att)位点，来自噬菌体DNA的attP元件以及在细菌基因组中存在的attB元件。这两个附着位点可能共有少至几个碱基对的序列同一性。重组酶蛋白与两个att位点结合，并催化DNA链的保守性和互换性交换，这导致环状噬菌体或质粒DNA整合入宿主DNA。也可能需要其他噬菌体或宿主因子，诸如DNA结合蛋白IHF、整合宿主因子，以获得有效率的反应(Friedman(1988)CelI 55:545-554;Finkel& Johnson(1992)Mol. Microbiol. 6:3257-3265)。在噬菌体生长循环的裂解阶段，噬菌体整合酶，与其他宿主和/或噬菌体因子联合起来，也将噬菌体基因组从细菌基因组切割下来。已经开发出若干方法，从而使得能对哺乳动物基因组进行操作，以便阐明特定的感兴趣基因的相关性和功能。在这些方法中，转基因小鼠株和基因靶向技术的开发已经证明是特别有用的(Brandon, E. P. , Idzerda, R. L. and McKnight, G. S. (1995) CurrBiol, 5, 625-34 ; Brandon, E. P. , Idzerda, R. L. and McKnight, G. S. (1995) Curr Biol,5，758-65)。伴随着位点特异性重组酶的表征和应用，这些技术已经取得了新的进步(Kilby, N. J. , Snaith, M. R. and Murray, J. A. (1993) Trends Genet, 9, 413-21)。位点特异性重组酶可以分为两个主要家族。第一个家族(Int家族或酪氨酸重组酶家族)包括这些酶，它们催化或者位于相同DNA分子中的位点之间的重组(分子内重组，导致分离、切除或倒位)或位于不同DNA分子中的位点之间的重组(分子间重组，导致整合)(Sauer, B. (1993)Methods EnzymoI, 225, 890-900 ；Dymecki, S.Μ. (1996)Proc Natl Acad Sci USA, 93, 6191-6 ；Abremski, K. and Hoess, R. (1984)J BiolChem, 259, 1509-14 ；Nash, H. A. (1996)in Escherichia coli and Salmonella cellularand molecular biology. , ed. F. C. Neidhart, R.1. Curtis, J. L.1ngraham, E. C. C. Lin, K.B. Low, B. Magasanik, ff. S. Rezaikof f, M. Ri ley, M. Schaechter and H. E. Umbager (A.S. M. Press, Washington D. C.)，pp. 2363-7)。后一特性已被开发利用，使得能将特异性序列革巴向插入到精确的位置(Sauer, B. and Henderson, N. (1990) The New Biologist, 2，441-9 ；Fukushige, S. and Sauer, B. (1992) Proc. Natl. Acad. Sc1. USA, 89, 7905-9)。已被用于操作哺乳动物基因组的重组酶主要是Cre蛋白和Flp蛋白，它们属于Int家族(Kilby，N.J. , Snaith, M. R. and Murray, J. A. (1993) Trends Genet, 9, 413-21)。这些酶的目标序列，对于Cre酶而言称为IoxP位点，对于Flp酶而言称为FRT,由短的反向重复组成，蛋白与反向重复结合。在基因组的长距离(高达70kb)上，重组过程是可操作的。通过使用这些酶，有若干作者已经报道了在鼠模型中的位点特异性和组织特异性DNA重组(DiSanto, J. P.，Muller, W.，Guy, G. D.，Fischer, A. and Rajewsky, K. (1995)Proc NatlAcad Sci USA, 92, 377-81 ；Gu, H. , Marth, J. D. , Orban, P. C, Mossmann, H. and Rajewsky, K.(1994) Science, 265, 103-6 ；Kuhn, R. , Schwenk, F. , Aguet, M. and Rajewsky, K. (1995)Science, 269, 1427-9 ；Orban, P. C, Chui, D. and Marth, J. D. (1992) Proc. Natl. Acad. Sc1.USA, 89, 6861-5),植物和动物中的染色体异位(Deursen, J. v. , Fornerod, Μ. , Rees, B.ν. and Grosveld, G. (1995) Proc. Natl. Acad Sc1. USA, 92, 7376-80 ；Medberry, S. L. , Dale, E. , Qin, M. and Ow, D. ff. (1995) Nucleic Acids Res, 23, 485-90 ；0sborne, B. L, ffirtz, U. and Baker, B. (1995) Plant J，7，687-701)，特定基因的靶向诱导(Pichel, J.G. , Lakso, M. and ffestphal, Η. (1993) Oncogene, 8, 3333-42)。Cre-1oxP 系统已经与诱导型启动子，如干扰素Y诱导型启动子联合应用，用于促进在肝脏中高效率地进行基因敲除，但使得基因敲除在其他组织中处于较小程度(Kuhn, R.，Schwenk, F.，Aguet, M. andRajewsky, K. (1995) Science, 269, 1427-9)。然而，位点特异性重组系统在相同的基因组中仅仅使诱导数量减少的重组事件成为可能。鉴于每一重组反应将处于基因组的交换位点处的目标序列交给重组酶处理，并且因为重组酶(例如Cre和Flp)能够催化分子间重组，所以整个过程可能导致不期望的染色体重排。重组酶的第二个家族统称为解离酶/转化酶家族或丝氨酸家族(Grindley，N.D. F. (1994)于 Nucleic本文档来自技高网...
【技术保护点】
在真核细胞中获得位点特异性重组的方法，所述方法包括：提供包含第一重组位点和第二重组位点的分离的真核细胞；将所述第一和第二重组位点与原核重组酶多肽接触，从而在所述重组位点之间产生重组，其中所述重组酶多肽能够介导所述第一和第二重组位点之间的重组，所述第一重组位点是噬菌体基因组重组附着位点(attP)或细菌基因组重组附着位点(attB)，所述第二重组位点是attB或attP，所述重组酶选自化脓性链球菌（Streptococcus?pyogenes）噬菌体重组酶或枯草芽孢杆菌（Bacillus?subtilis）噬菌体重组酶，条件是当第一重组附着位点是attB时，所述第二重组附着位点是attP；当第一重组附着位点是attP时，第二重组附着位点是attB。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：M·帕迪达姆，
申请(专利权)人：英特拉克森公司，
类型：发明
国别省市：
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