底物特异性得到改变的阿马多里酶制造技术

本发明专利技术的目的是提供对果糖基缬氨酰基组氨酸的底物特异性高的阿马多里酶。本发明专利技术是在与选自来自锥毛壳（Coniochaeta）属的阿马多里酶的98位、259位、154位、125位、261位、263位、106位、103位、355位、96位、66位、67位、70位、100位、110位、113位、114位和156位中的氨基酸对应的位置具有1个或更多的氨基酸残基的取代的阿马多里酶，根据本发明专利技术，即便是在ε-果糖基赖氨酸的存在下，也能够正确测定来自糖化血红蛋白的β链氨基末端的α-果糖基缬氨酰基组氨酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及底物特异性得到改变的阿马多里酶、其基因和重组体DNA、以及底物特异性得到改变的阿马多里酶的制造方法。
技术介绍
糖化蛋白质是葡萄糖等醛糖(潜在地具有醛基的单糖及其衍生物)的醛基与蛋白质的氨基以非酶方式形成共价键并进行阿马多里重排而生成的。作为蛋白质的氨基，可举出氨基末端的α氨基、蛋白质中的赖氨酸残基侧链的ε氨基。作为在生物体内产生的糖化蛋白质，已知血液中的血红蛋白被糖化而成的糖化血红蛋白、白蛋白被糖化而成的糖化白蛋白等。这些在生物体内产生的糖化蛋白质中，在糖尿病的临床诊断领域中，作为用于糖尿病患者的诊断、症状管理的重要的血糖对照标记，糖化血红蛋白(HbAlc)受到关注。血液中的HbAlc浓度反映过去的一定期间的平均血糖值，其测定值在糖尿病症状的诊断、管理中成为重要的指标。作为迅速且简便地测定该HbAlc的方法，提出了使用阿马多里酶的酶方法，S卩，将HbAlc用蛋白酶等分解，对从其β链氨基末端游离的α-果糖基缬氨酰基组氨酸(以下表示为aFVH)、或a -果糖基缴氨酸(以下表示为a FV)进行定量的方法(例如,参照专利文献I 6)。实际上，从HbAlc切出a FV的方法被认为夹杂物等带来的影响大，特别是现在测定a FVH的方法成为主流。阿马多里酶催化如下反应:在氧存在的条件下，将亚氨基二乙酸或其衍生物(也称为“阿马多里化合物”)氧化，生成乙醛酸或a -酮醛、氨基酸或肽、以及过氧化氢。就阿马多里酶而言，从细`菌、酵母、真菌中发现，而作为特别是对HbAlc的测定有用的具有对a FVH和/或a FV的酶活性的阿马多里酶，例如报告了来自锥毛壳(Coniochaeta)属、正青霉(Eupenicillium)属、节菱抱(Arthrinium)属、弯抱(Curvularia)属、小球腔菌(Leptosphaeria)属、新赤壳菌(Neocosmospora)属、蛇抱腔菌(Ophiobolus)属、格孢腔菌(Pleospora)属、棘壳孢(Pyrenochaeta)属、隐球菌(Cryptococcus)属、暗球腔菌(Phaeosphaeria)属、曲霉(Aspergillus)属、细基格抱(Ulocladium)属、青霉(Penicillium)属的阿马多里酶(例如，参照专利文献1、7 11,非专利文献I 4)。应予说明，上述报告例中，根据文献不同，阿马多里酶有时也被记载为酮胺氧化酶、果糖基氨基酸氧化酶、果糖基肽氧化酶、果糖基胺氧化酶等表达。利用酶方法的HbAlc的测定中，作为阿马多里酶的性质要求严格的底物特异性。例如，如上所述，通过将游离的aFVH进行定量而实施HbAlc的测定时，优选使用对于在样品中以游离状态存在的、和/或在使用了蛋白酶等的HbAlc的处理工序中游离的除了 a FVH以外的糖化蛋白质氨基酸、糖化蛋白质肽难以作用的阿马多里酶。特别是，已知血红蛋白分子中所含的赖氨酸残基侧链的ε位的氨基受到糖化，启示来自该受到糖化的赖氨酸残基的ε位氨基被糖化的ε-果糖基赖氨酸(以下表示为ε FK)通过蛋白酶处理等而被游离(例如，参照非专利文献5)。因此，强烈期望难以对可成为测定误差的原因物质的eFK进行作用的、底物特异性高的阿马多里酶。另一方面，以往已知的阿马多里酶的大部分不能说对ε FK的反应性充分低。作为通常的技术，已知为了改变酶的底物特异性，对编码酶的DNA加入变异，对酶的氨基酸导入取代，选拔具备目标底物特异性的酶的方法。另外，在同源性高的酶中，在已知通过氨基酸取代而提高底物特异性这样的例子的情况下，也可以基于该信息来预想底物特异性的提闻。实际上,关于来自棒弯孢(Curvularia clavata) ΥΗ923的酮胺氧化酶以及来自侵管新赤壳菌(Neocosmospora vasinfecta) 474的酮胺氧化酶,示出了通过取代多个氨基酸而提高了对a FVH的底物特异性的改变型酮胺氧化酶(参照专利文献I )。例如，在来自棒弯孢ΥΗ923的酮胺氧化酶中，通过将58位的异亮氨酸取代为缬氨酸、将62位的精氨酸取代为组氨酸、将330位的苯丙氨酸取代为亮氨酸，从而对ε -果糖基-(α -苄氧基羰基赖氨酸)(以下表示为ε FZK)的酶活性除以对a FVH的酶活性而导出的活性比ε FZK/ a FVH显示出从0.95向0.025减少。但是，就在上述文献中被用于评价改变型酮胺氧化酶的底物特异性的SFZK而言，与在将糖化血红蛋白用蛋白酶进行处理的工序中实际产生的eFK相比，在分子量、结构方面是相当不同的化合物。因此，难以根据对eFZK的反应性减少而说明对可成为实际测定误差的原因物质的eFK的反应 性减少。另外，也没有记载使用上述文献中的改变型酮胺氧化酶来确认对ε FK的反应性的减少的内容。除此以夕卜,还报告了通过对来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans) A89的果糖基氨基酸氧化酶导入氨基酸取代来改变底物特异性，从而新赋予了对a FVH的反应性的改变型果糖基氨基酸氧化酶(例如，参照专利文献10)。例如，显示了将来自构巢曲霉Α89的果糖基氨基酸氧化酶的59位的丝氨酸取代为甘氨酸、且将65位的赖氨酸取代为甘氨酸，或将109位的赖氨酸取代为谷氨酰胺，从而对aFVH新赋予酶活性。但是，并没有记载该氨基酸取代有助于对eFK的反应性的减少。另外，除此以外，还报告了通过对来自构巢曲霉A89的果糖基氨基酸氧化酶导入氨基酸取代来改变底物特异性，从而使对ε FK的酶活性除以对a FV的酶活性而得到的活性比ε FK/a FV减少的改变型果糖基氨基酸氧化酶(例如，参照专利文献12)。但是，对于该改变酶的对a FVH的酶活性没有任何提及。即，就包括天然型或变异型阿马多里酶在内的对ε FK的酶活性除以对a FVH的酶活性而导出的活性比ε FK/a FVH低和/或ε FK/a FV低的阿马多里酶的例子而言，迄今为止仅有极少报告，依然要求能够实现精度高的HbAlc的测定的、对ε FK的反应性充分低的阿马多里酶。专利文献1:国际公开第2004/104203号专利文献2:国际公开第2005/49857号专利文献3:日本特开2001-95598号公报专利文献4:日本特公平05-33997号公报专利文献5:日本特开平11-127895号公报专利文献6:国际公开第97/13872号专利文献7:日本特开2003-235585号公报专利文献8:日本特开2004-275013号公报专利文献9:日本特开2004-275063号公报专利文献10:日本特开2010-35469号公报专利文献11:日本特开2010-57474号公报专利文献12:日本特开2010-104278号公报非专利文献非专利文献I:Biochem.Biophys.Res.Commun.311, 104-11，2003非专利文献2:Biotechnol.Bioeng.106, 358-66, 2010非专利文献3 J.Biosc1.Bioeng.102，241-3，2006非专利文献4:Eur.J.Biochem.242，499-505，1996非专利文献5 J.Biol.Chem.279，27613-20，200
技术实现思路
本专利技术所要解决的课题是提供对ε FK的反应性低，具本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.08.06 JP 2010-176967;2010.09.24 JP 2010-213071.一种阿马多里酶，具有以下(a)和/或(b)的性质: (a)具有在序列号I所示的氨基酸序列进行了I个或多个氨基酸的缺失、插入、添加和/或取代的氨基酸序列，与具有序列号I所示的氨基酸序列的阿马多里酶相比较，对ε-果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酰基组氨酸的反应性的比例减少； (b)具有在序列号I所示的氨基酸序列进行了I个或多个氨基酸的缺失、插入、添加和/或取代的氨基酸序列，与具有序列号I所示的氨基酸序列的阿马多里酶相比较，对ε-果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酸的反应性的比例减少。2.—种阿马多里酶，其特征在于，在序列号I所示的氨基酸序列的与选自以下(C)至(S)中的氨基酸对应的位置具有I个或更多的氨基酸残基的取代，与进行所述取代之前的阿马多里酶相比较，对ε-果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酰基组氨酸的反应性的比例减少，和/或与进行所述取代之前的阿马多里酶相比较，对ε -果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酸的反应性的比例减少， (C) 98位的谷氨酸 Cd) 259位的缬氨酸 Ce) 154位的丝氨酸 Cf) 125位的组氨酸 (g)261位的酪氨酸 (h)263位的甘氨酸 (i)106位的天冬氨酸 (j) 103位的甘氨酸 (k) 355位的丙氨酸 (I)96位的天冬氨酸 (s) 66位的赖氨酸或/和67位的缬氨酸 Cm) 70位的谷氨酰胺 (ο) 100位的苏氨酸 (P) 110位的谷氨酰胺 (q) 113位的丙氨酸 Cr) 114位的亮氨酸 (s) 156位的天冬氨酸。3.—种阿马多里酶，其特征在于，序列号I所示的氨基酸序列的氨基酸的与选自以下(t)至(aj)中的I个或更多的氨基酸对应的位置的氨基酸被取代为以下(t)至(aj)的各项中记载的取代后的氨基酸残基，与进行所述取代之前的阿马多里酶相比较，对ε -果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酰基组氨酸的反应性的比例减少，和/或与进行所述取代之前的阿马多里酶相比较，对ε-果糖基赖氨酸的反应性相对于对α-果糖基缬氨酸的反应性的比例减少: (t) 98位的谷氨酸被脯氨酸以外的氨基酸，即谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸所取代； (U) 259位的缬氨酸被丙氨酸、半胱氨酸、丝氨酸所取代；(v)154位的丝氨酸被甘氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、半胱氨酸所取代； (w)125位的组氨酸被丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸所取代； (X) 261位的酪氨酸被丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、赖氨酸所取代； (y) 263位的甘氨酸被赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸所取代； (z) 106位的天冬氨酸被分子量比天冬氨酸小的氨基酸，即甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺所取代； (aa)103位的甘氨酸被赖氨酸、精氨酸、组氨酸所取代； (ab)355位的丙氨酸被赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸所取代； (ac)96位的天冬氨酸被丙氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：一柳敦，广川浩三，田锅康子，钺阳介，
申请(专利权)人：龟甲万株式会社，
类型：
国别省市：