本发明专利技术公开的是使用逆转录病毒载体用于将基因引入靶细胞内的方法，其是简单和高度有效的。具体公开的是使用逆转录病毒载体用于将基因引入靶细胞内的方法，其包括步骤（a）将含有逆转录病毒载体（在其上具有携带的外源基因）的液体置于在其上已固定逆转录病毒结合物质的培养容器内，并且在低于25℃的温度温育液体4小时或更久，从而产生具有与之结合的逆转录病毒载体的培养容器，和（b）将靶细胞加入已在步骤（a）中产生的培养容器内，并且温育培养容器。该基因引入方法是简单和高度有效的，并且在医学、细胞技术、基因技术、发育技术等领域中是特别有用的。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及使用逆转录病毒载体用于将外源基因转移到靶细胞内的方法。
技术介绍
近来，用于治疗严重遗传疾病、癌症等的基因疗法已得到开发。已检查对于人的临床应用的大多数基因疗法迄今为止涉及使用重组逆转录病毒载体将基因转移到细胞内。逆转录病毒载体可以将目的外源基因稳定整合到靶细胞的染色体DNA内。因此，通过逆转录病毒载体的基因转移是特别用于其中希望长期基因表达的基因疗法的基因转移的优选方式。 已报道使用逆转录病毒载体的基因转移效率通过使用细胞粘合物质得到增加，所述细胞粘合物质结合逆转录病毒，例如纤连蛋白或纤连蛋白片段CH-296 (例如专利文献I)。此外，已报道基因转移效率通过这样的方法进一步增加，所述方法包括将含有逆转录病毒载体的溶液加入用RetroNectin (注册商标)包被的容器，随后温育一定时间段以仅允许病毒载体结合在RetroNectin (注册商标)上，去除含有针对感染的抑制物质的上清液，并且随后加入祀细胞(RetroNectin Bound Virus Infection方法RBV方法)(专利文献2，非专利文献I)。在RBV方法中病毒载体与RetroNectin (注册商标)的结合可以通过利用离心力(离心RBV方法)得到增强。然而，离心RBV方法需要可以忍受离心力的容器和用于离心操作的昂贵仪器，并且该操作包括多步。此外，还存在当需要基因转移到大量细胞内时，难以按比例扩大处理能力的问题。引用列表 专利文献 专利文献I W0 95/26200 专利文献2 W0 00/01836 非专利文献 非专利文献 I J. Biochem.，第 130 卷，第 331-334 页(2001)。专利技术概述 技术问题 本专利技术的目的是提供使用逆转录病毒载体用于将基因转移到靶细胞内的方便和有效方法。问题的解决方案 具体地，本专利技术涉及 使用逆转录病毒载体将外源基因转移到靶细胞内的方法，该方法包括下述步骤(a)和(b) (a)将含有携带外源基因的逆转录病毒载体的液体置于在其上固定逆转录病毒结合物质的培养容器中，随后在小于25°C的温度温育4小时或更久，以获得逆转录病毒载体与之结合的培养容器；和 (b)将靶细胞加入通过步骤(a)获得的培养容器内，随后温育； 根据项目的方法，其中在步骤(a)中的温育时间是超过5小时且不超过48小时； 根据项目的方法，其中在步骤(a)中的温育是伴随振荡的温育； 根据项目用于转移基因的方法，其包含下述步骤(a)至(b2): (a)将含有携带外源基因的逆转录病毒载体的液体置于在其上固定逆转录病毒结合物质的培养容器内，随后在小于25°C的温度温育4小时或更久，以获得逆转录病毒载体与之结合的培养容器； (bl)洗涤通过步骤(a)获得的培养容器；和 (b2)将靶细胞加入在步骤(bl)洗涤的培养容器内，随后温育； 根据项目的方法，其中逆转录病毒结合物质是选自下述的至少一种纤连蛋白、成纤维细胞生长因子、胶原V型、聚赖氨酸和DEAE-葡聚糖、及其片段； 根据项目的方法，其中逆转录病毒结合物质还具有细胞结合活性； 根据项目的方法，其中在其上固定逆转录病毒结合物质的培养容器是在其上固定逆转录病毒结合物质和细胞结合物质的培养容器；和 根据项目的方法，其中具有的细胞结合物质是选自下述中的至少一种细胞粘附蛋白质、激素、细胞因子、抗体、糖链、碳水化合物和代谢产物。专利技术的有利效应 根据本专利技术，提供了方便和有效的基因转移方法。用于实施本专利技术的方式 本专利技术的基因转移方法包括步骤(a) “将含有携带外源基因的逆转录病毒载体的液体置于在其上固定逆转录病毒结合物质的培养容器中，随后在小于25°C的温度温育4小时或更久，以获得逆转录病毒载体与之结合的培养容器”;和步骤(b) “将靶细胞加入通过步骤Ca)获得的培养容器内，随后温育”。如本文使用的逆转录病毒共同意指属于逆转录病毒科的RNA病毒，所述逆转录病毒科的基因组由RNA组成且在受感染细胞中具有将RNA转换为DNA的生命周期，并且包括致癌逆转录病毒(oncoretroviruses)和慢病毒。致癌逆转录病毒的例子包括莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)。慢病毒的例子包括人免疫缺陷病毒I型(HIV-I)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)0如本文使用的，逆转录病毒载体指通过重组DNA技术在逆转录病毒例如致癌逆转录病毒或慢病毒的基础上产生的病毒颗粒，并且包括致癌逆转录病毒载体、慢病毒载体及其假型载体。致癌逆转录病毒载体的例子包括基于MMLV的载体。慢病毒载体的例子包括基于HIV-I的载体和基于SIV的载体。假型载体指具有衍生自不同于Gag和Pol蛋白质起源的病毒的Env蛋白质的重组逆转录病毒载体。假型载体的例子包括具有衍生自下述等的Env蛋白质的致癌逆转录病毒和慢病毒载体水泡性口炎病毒(VSV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫内源病毒RD114、鼠白血病病毒(亲嗜性-env、双嗜性-env、10Al-env等)。在本专利技术中，优选使用复制缺陷型重组逆转录病毒载体。消除复制缺陷型重组逆转录病毒载体的复制能力，从而使得载体不能在受感染细胞中自主复制，并且因此载体是非致病性的。载体可以感染宿主细胞例如脊椎动物细胞，特别是哺乳动物细胞，且将由载体携带的外源基因稳定整合到宿主细胞的染色体DNA内。在步骤(a) “将含有携带外源基因的逆转录病毒载体的液体置于在其上固定逆转录病毒结合物质的培养容器中，随后在小于25°C的温度温育4小时或更久，以获得逆转录病毒载体与之结合的培养容器”中使用的含有逆转录病毒载体的液体并无具体限制，并且其例子包括含有逆转录病毒载体的病毒生产细胞的培养上清液。在步骤(a)中，在将含有携带外源基因的逆转录病毒载体的液体置于在其上固定逆转录病毒结合物质的培养容器中之后，可以将所述含有液体的培养容器冷冻且贮存一定时期。在这种情况下，可以对已冷冻且贮存的具有含有逆转录病毒载体的液体的培养容器直接实施在小于25°C的温度4小时或更久的温育。即，用于解冻的另外步骤不是特别要求的。在这种情况下，希望在步骤(a)中的温育可以是伴随振荡的温育。用于产生逆转录病毒载体的一般过程的例子包括包含将携带外源基因和包装信号的转移载体引入逆转录病毒包装细 胞内的过程，其中编码逆转录病毒结构蛋白质的基因例如gag-pol基因和env基因先前整合到其染色体内，和包含用上述转移载体和具有编码逆转录病毒结构蛋白质例如gag-pol基因和env基因的包装质粒共转染不含逆转录病毒结构蛋白质的细胞的过程。在合适启动子例如逆转录病毒载体中存在的LTR启动子或外源启动子的控制下，可以通过由重组逆转录病毒载体携带使用待转移到靶细胞内的外源基因。此外，与启动子和转录起始位点合作的另一种调节元件(例如增强子序列、终止序列或内含子序列)可以存在于载体中，以便完成外源基因的有效转录。待转移到靶细胞内的外源基因可以是天然存在的基因或人工制备的基因。可替代地，外源基因可以是其中不同起源的DNA分子通过已知方法例如连接结合在一起的那种。希望转移到细胞内的任何基因可以选择为由逆转录病毒载体携带的外源基因。例如，编码与待治疗的疾病相关的酶或蛋白质的基因、细胞内抗体(参见例如WO 94本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：百百克行，齐藤尚纪，蝶野英人，峰野纯一，
申请(专利权)人：宝生物工程株式会社，
类型：
国别省市：
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