本发明专利技术公开一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物。还公开使用本试剂盒原位杂交检测与老年性痴呆（Alzheimer’sDisease-AD）前期病理演变有密切相关的APOE-4基因的mRNA方法，包括以下步骤：（1）在杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和（2）检测所述杂交复合体。本发明专利技术的试剂盒和检测方法可以在，mRNA水平上检测APOE-4基因的表达功能，比现有的临床生化检测指标和影像医学检查更早期，能实现真正的老年性痴呆（AD）病变前期mRNA水平的筛查，做到预防性诊治的目的。同时，本发明专利技术的检测方法简单方便，成本低,便于医院推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测领域，更具体地说，是涉及与老年性痴呆（AD）病变前期mRNA表达改变(病理演变过程)的相关检测技术。
技术介绍
阿尔茨海默病( Alzheimer’s disease-,AD)是最常见的痴呆类型，占所有痴呆的60%~80%，也是致残率高和负担大的疾病之一。到2006年，人类第一杀手心脏病死亡率比2000年下降了11.5%，第二杀手卒中死亡率下降了18.1%，但阿尔茨海默病的死亡率却上升了47.1%，成为老年人的第5位致死原因。随着全球性人口规模和预期寿命的增加，阿尔茨海默病已成为世界卫生问题，根据未来的预测，痴呆患病率每二十年增加近一倍，至2030年将达到6570万，到2050年将达到1亿1540万。各国阿尔茨海默病患者数增加不是均衡的。发达国家的痴呆人数预测以100%的比例增长，而中国/印度及其南亚和西太平洋邻国等发展中国家将以超过300%的比例增长，中国的AD人数则将以336%的比例增长。中国是世界上人口老化基数最大国家，截止2008年底，我国60岁以上老年人口已接近1.69亿，占总人口的12%。根据2005年北京协和医院领导的一项跨省市（北京/上海/成都/西安）流行病学调查结果估计，65岁以上老年人AD患病率为4.8%，且随着年龄增长而增加。因此，中国绝不是一个AD低发国家，恰恰相反，而是世界上AD人数最多且增长速度最快的国家。因此迅猛增加的疾病负担必将对我国的社会经济发展和家庭生活产生重要影响。 AD是世界上致残率高且负担重的疾病。按照2003年度世界卫生组织报导的关于全球疾病负担的估计，60岁以上老年人中痴呆导致残疾的占11.2%，远高于卒中（9.5%）、骨骼肌障碍（8.9%）、心血管病（5%）及各种类型的癌症（2.4%）。据美国一个跨学科专家组的共识估计，除脊髓损伤和晚期癌症以外，AD致残加权显著高于任何其他健康状况。在美国，AD人口已超过500万，AD的花费已超过1000亿美元，估计到2050年AD患者人数将以几何级数方式增长到1300万人,经过核算，每年将花费1400亿美元。 AD已成为重大的公共卫生问题，并确定为未来几年公共卫生问题的研究重点。AD是一种常见的神经系统退行性疾病, 临床表现为进行性认知功能减退，典型病理改变为老年斑( sen ile plaque, SP)、神经原纤维缠结( neurona l fibrillary tang les, NFT) 及神经元丢失, 另外伴有颗粒空泡变性( granulov acuolar degeneration,GD),平野小体和脑血管的改变。经过数十年有关AD的病因和发病机制的研究后，虽然对AD的病因还有许多不了解，但是对其病理和生理机制有了肯定和全面的认识，并从中发现了一些重要的疾病标志。现代分子遗传学在帮助人类认识AD的发病机制方面意义非凡，发现常染色体突变能导致Aβ42肽的表达增多。这些基因包括与早发型阿尔茨海默病相关的21号染色体上的淀粉样前体蛋白（APP)、14号染色体上的早老素1（PS1）和1号染色体上的早老素2（PS2)的突变，疾病标志还包括以及晚发型阿尔茨海默病相关的19好染色体上的载脂蛋白E（APOE)基因，科学家在对6００多名北美人进行调查后，发现了APOE-4基因突变与AD的发病关系，该基因控制产生的一种酶，能帮助大脑分解多余的胆固醇，在他们的研究中，那些体内APOE-4基因产生变异的人，不仅患老年性痴呆症的风险增加，大脑中的胆固醇也会增多。此前，其他科学家们曾发现，ＡＰＯＥ－４的基因产生变异，也会增加人患老年性痴呆症的风险。这个基因在人体胆固醇的运输过程中起到作用。瑞士科学家的新研究则显示，ＣＹＰ４６和ＡＰＯＥ－４基因都产生变异的患者，患老年性痴呆症的风险比正常人高将近１０倍，而且这类患者大脑中贝塔－淀粉状蛋白质的含量也最高。老年性痴呆症是阿尔茨海默氏症（即早老性痴呆症）的一种，一般在６５岁以后发病，病情会缓慢加重，主要症状是记忆受损。老年性痴呆症的确切病因目前尚不清楚，但解剖研究发现，患者大脑中贝塔－淀粉蛋白含量会异常增多。一些科学家据此推测，贝塔－淀粉蛋白可能会干扰脑细胞间的电信号传输，最终引发细胞大量死亡。发现的APOE-4基因进一步表明，胆固醇和贝塔－淀粉蛋白的积聚之间也许存在某种关联，人体胆固醇新陈代谢的不足，有可能是导致老年性痴呆症的“罪魁祸首”。 AD的生物标志物能很好地帮助临床诊断，与病理发现有良好的一致性。2010年美国国立老化研究院和阿尔茨海默病联合会推荐新的诊断定义与标准，强调将记忆损害与生物标志物结合。AD是疾病的整个临床过程，包括了AD痴呆前期和痴呆期AD。AD的临床前驱期则指出现早期病理生理学改变至出现最早的认知症状之间漫长的阶段。当前，临床使用的AD治疗药物不少，但均缺乏有临床意义的疗效。痴呆是严重的认知功能损害，呈进展性和不可逆性，要通过药物干预实现病情稳定或缓解是极其困难的。因此，对痴呆实施预防应该是一个重要的临床研究方向。最新AD研究报告表明，作为“婴儿”这一代，到2050年在美国将有1千3百50万人成为AD痴呆患者。如果，假设有一种干预可以是AD痴呆的发病延迟5-10年或提早5-10预测和筛查，那么AD痴呆患者人数将减少80%，用于AD的预计医疗费用将会大大减少。因此，寻找有效AD筛查工具，对临床前期AD患者及未发生AD高危人群的早期筛查，在人群中尽早开展干预治疗，减少AD的最终发生率有重要的临床和时代意义。尽早开发出应用于AD病变前期mRNA水平筛查试剂盒，这将改变目前临床上的AD发生后的诊治模式，将AD的诊治提高、提前到病变前期，做到预防性（治未病）的早期介入和治疗，并进一步做到mRNA水平的调控及基因早期治疗，将AD消灭在萌芽状态。本专利技术人在长期研究中发现，导致老年性痴呆治疗效果不佳的主要原因是不能做到真正的早期诊断。本课题拟采用核酸原位杂交技术，寻找与AD发病密切相关的CYP46基因一级转录功能产物-mRNA，观察其在AD病人、高危人群、正常对照人群表达变化，统计分析其临床应用意义和价值，并培养、开发出可应用于临床的早期筛查试剂盒，用于临床前期AD患者及高危人群的早期筛查，做到预防性诊治，尽早开展干预治疗，减少AD的最终发生率。随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，疾病基因组学等研究的深入展开，为了寻求更早期的筛查和治疗老年性痴呆、以及预防老年性痴呆，已取得长足进步。至今，我们已有可能在基因的一级转录功能产物（mRNA水平）上做更精确的早期筛查和诊断，在老年性痴呆症的基因生理病理学演变前期,就可以做到早期预测和筛查。本专利技术采用核酸原位杂交技术，选择多组临床标本（老年性痴呆患者、高危人群、正常对照），对APOE-4基因与老年性痴呆症的早期预警进行检测分析。APOE-4基因的mRNA作为早期筛查老年性痴呆病变前期有非常重要的临床诊断意义。APOE-4基因的mRNA在老年性痴呆症前期及病变过程中表达过度。它作于老年性痴呆病变前期筛查、及老年性痴呆症早期预防的检测指标及治疗后的复发预警也有非常重要的临床意义。专利技术人在长期本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物，其特征在于，所述的杂交探针为序列表SEQ？ID？NO.1所示序列的互补序列。
【技术特征摘要】
1.一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物，其特征在于，所述的杂交探针为序列表SEQ ID NO.1所示序列的互补序列。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的标记物选自放射性物质、化学发光或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶及纳米材料。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括杂交液。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括增效剂。
5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括显色剂。
6.一种APOE-4基因原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
（1）在权利要求1所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，...
【专利技术属性】
技术研发人员：张玉丽，裘建英，张云福，裘霖，
申请(专利权)人：芮屈生物技术上海有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。