用于产生内皮细胞的方法技术

本发明专利技术涉及一种用于产生内皮细胞的方法，其中按以下顺序进行步骤(a)在不形成胚状体的情况下从多能干细胞诱导含有内皮祖细胞的中胚层细胞群，和步骤(b)在存在RepSox的情况下培养含有内皮祖细胞的中胚层细胞群。根据本发明专利技术，从多能干细胞高效率地产生高质量的内皮细胞变成可能。通过本发明专利技术的方法产生的内皮细胞可用于例如产生心肌细胞层，并且预期用于治疗心脏疾病。通过将通过本发明专利技术的方法产生的内皮细胞与心肌细胞和壁细胞混合并然后培养该混合物，可产生心肌细胞层。

A Method for Producing Endothelial Cells

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于产生内皮细胞的方法
本专利技术涉及用于从多能干细胞产生高质量的内皮细胞的方法。
技术介绍
已经开发了与再生疗法相关的技术创新，特别是用于产生多能干细胞的方法及用于诱导多能干细胞的分化的方法，使得已深入进行了针对生物组织的再生的研究。而且对于对单个生物的生命维持必不可少的心脏，认为再生医学技术可用于治疗心脏疾病。例如，已经尝试将从多能干细胞人工产生的心肌细胞应用于心脏疾病的治疗。此时心肌细胞不是单独使用，而是例如已经开发了用于形成含有心肌细胞的层状细胞构造的方法(专利公布1)，并且已经在具有心肌梗塞的模型动物中显示出由此获得的心肌层的有用性。在专利公布1中，通过将心肌细胞与内皮细胞、壁细胞和Flk/KDR阳性细胞组合并培养细胞来产生心肌层。尽管以上公布公开了作为细胞混合物制备多种细胞比如心肌细胞、内皮细胞和壁细胞的方法，但是从控制心肌层的质量或产生过程的观点来看，期望单独制备这些细胞。另外，当人工构建除血管以外的组织或器官时，预期内皮细胞被用作用于组织中形成的血管的材料。已知有几种用于产生内皮细胞的方法。一种用于从多能干细胞有效产生内皮细胞的方法为例如专利公布2中描述的方法。尽管该方法为在含有不同活性成分的多种培养基中逐步培养多能干细胞的方法，但仍然存在改善所获得的细胞质量的空间。现有技术参考文献专利公布专利公布1：WO2012/133945专利公布2：WO2014/192925专利技术概述本专利技术要解决的问题为了使用内皮细胞作为用于产生如上所述的心肌层的材料并使用内皮细胞本身作为医学组合物或用于研究的材料，期望一种有效产生更高质量的内皮细胞的方法。本文使用的术语“高质量的内皮细胞”是指具有一种或多种以下特征的内皮细胞，比如获得的细胞数量高、纯度高(内皮细胞标志物的阳性率高)、分化阶段为同质的、具有极好的细胞增殖能力(例如幼年)、更不易受冷冻和解冻损伤的影响、和批次之间的差异小。本专利技术旨在解决常规产生方法所具有的问题，并且本专利技术的目的为提供一种用于产生高质量的内皮细胞的方法。解决问题的方法作为解决上述问题的深入研究的结果，本专利技术人首次发现当从多能干细胞诱导内皮细胞时，通过在存在不含RepSox的培养基的情况下培养内皮祖细胞可获得大量的高纯度内皮细胞。进一步地，本专利技术人已经发现，通过以上方法获得的大多数内皮细胞为幼年内皮细胞，并且甚至在冷冻保存之后也保持高成活力和增殖率。本专利技术基于上述发现得以完成。具体来说，本专利技术涉及：[1]一种用于产生内皮细胞的方法，其包括按以下顺序进行：(a)在不形成胚状体的情况下从多能干细胞诱导含有内皮祖细胞的中胚层谱系细胞群；和(b)在存在RepSox的情况下培养含有内皮祖细胞的中胚层谱系细胞群。[2]以上[1]的方法，其中多能干细胞为胚胎干细胞(ES细胞)或诱导性多能干细胞(iPS细胞)；[3]以上[1]或[2]的方法，其中在步骤(a)中在以下培养基中依序培养多能干细胞：(i)含有激活素A的培养基，(ii)含有骨形态发生蛋白4的培养基，和(iii)含有血管内皮生长因子的培养基；[4]以上[3]的方法，其中(ii)含有骨形态发生蛋白4的培养基进一步含有碱性成纤维细胞生长因子；[5]以上[1]~[4]中任何一项的方法，其特征为在步骤(a)之后进一步包括(a')从中胚层谱系细胞群分离内皮祖细胞；[6]以上[5]的方法，其中在步骤(a')中，激酶插入结构域受体阳性细胞被分离为内皮祖细胞；[7]以上[1]~[6]中任何一项的方法，其中在步骤(b)之前，含有内皮祖细胞的中胚层谱系细胞群或分离的内皮祖细胞在没有RepSox的培养基中进行培养；[8]以上[1]~[7]中任何一项的方法，其特征为在步骤(b)之后进一步包括(c)冷冻内皮细胞；[9]一种用于产生心肌层的方法，其包括：根据以上[1]~[8]中的任何一项定义的方法产生内皮细胞，和将内皮细胞与心肌细胞和壁细胞混合以培养细胞；和[10]含有激酶插入结构域受体阳性内皮祖细胞和RepSox的细胞组合物。专利技术效果根据本专利技术的方法，可从多能干细胞有效地产生高质量的内皮细胞。根据本专利技术的方法获得的内皮细胞可用于产生例如心肌层，并且预期用于治疗心脏疾病。进一步地，细胞可用作由内皮细胞的异常等引起的疾病的细胞模型，或者作为药物安全性评价的材料。另外，通过将通过本专利技术的方法获得的内皮细胞与心肌细胞和壁细胞混合并培养细胞，可产生心肌层。用于实施本专利技术的方式本专利技术将在下文详细说明。本文使用的术语“多能干细胞”是指具有能够分化成多种细胞的多能性以及还具有自我增殖能力的干细胞，并且多能干细胞包括例如(但不限于)诱导性多能干细胞(iPS细胞)、胚胎干细胞(ES细胞)、种系干细胞(GS细胞)、胚胎生殖细胞(EG细胞)、源自通过核移植获得的克隆胚胎的胚胎干细胞(核移植ES细胞；ntES细胞)、融合干细胞等。优选的多能干细胞为iPS细胞或ES细胞，并且更优选的多能干细胞为iPS细胞。iPS细胞为一种体细胞来源的人工干细胞，其具有与ES细胞几乎相同的特性，例如分化多能性和通过自我复制的增殖能力，并且iPS细胞可通过将核酸或蛋白质形式的特定核重编程物质引入到体细胞中或通过用试剂增加核重编程物质的内源性mRNA和/或蛋白质的表达水平来产生(K.Takahashi和S.Yamanaka(2006),Cell,126:663-676;K.Takahashi等(2007),Cell,131:861-872;J.Yu等(2007),Science,318:1917-1920;和M.Nakagawa等(2008),Nat.Biotechnol.,26:101-106)。核重编程物质可为在ES细胞中特异性表达的基因或者在维持ES细胞的未分化状态中起重要作用的基因或其基因产物。该物质包括例如(但不特别限于)Oct3/4、Klf4、Klf1、Klf2、Klf5、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Sox18、c-Myc、L-Myc、N-Myc、TERT、SV40大T抗原、HPV16E6、HPV16E7、Bmil、Lin28、Lin28b、Nanog、Esrrb或Esrrg。当建立iPS细胞时，这些核重编程物质可组合使用。例如，该组合包括至少1种、2种或3种上述核重编程物质，和优选地该组合包括4种上述核重编程物质。作为细胞系建立的人iPS细胞系可用于本专利技术的实施方案中。优选的人iPS细胞系为(但不特别限于)ChiPSC7、ChiPSC11、ChiPSC12、ChiPSC19、ChiPSC20、ChiPSC21、ChiPSC22、ChiPSC23、201B7、201B7-Ff、253G1、253G4、1201C1、1205D1、1210B2和836B3，和更优选的人iPS细胞系为ChiPSC12。上述人iPS细胞系可从Cellartis或iPSAcademiaJapan,Inc.或CenterforiPSCellResearchandApplication,KyotoUniversity获得。ES细胞为从哺乳动物比如人或小鼠的早期胚胎(例如胚泡)的内细胞团建立，并且具有分化多能性和通过自我复制的增殖能力的干细胞。1981年在小鼠中发现了ES细胞(M.J.Evans和M本文档来自技高网...

【技术保护点】
1. 一种用于产生内皮细胞的方法，其包括按以下顺序进行：(a) 在不形成胚状体的情况下，从多能干细胞诱导包含内皮祖细胞的中胚层谱系细胞群；和(b) 在存在RepSox的情况下培养包含内皮祖细胞的中胚层谱系细胞群。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.02 JP 2016-2345981.一种用于产生内皮细胞的方法，其包括按以下顺序进行：(a)在不形成胚状体的情况下，从多能干细胞诱导包含内皮祖细胞的中胚层谱系细胞群；和(b)在存在RepSox的情况下培养包含内皮祖细胞的中胚层谱系细胞群。2.权利要求1的方法，其中所述多能干细胞为胚胎干细胞(ES细胞)或诱导性多能干细胞(iPS细胞)。3.权利要求1或2的方法，其中在步骤(a)中在以下培养基中依序培养所述多能干细胞：(i)包含激活素A的培养基，(ii)包含骨形态发生蛋白4的培养基，和(iii)包含血管内皮生长因子的培养基。4.权利要求3的方法，其中(ii)包含骨形态发生蛋白4的培养基进一步包含碱性成纤维...

【专利技术属性】
技术研发人员：山本由姬，榎龙嗣，户坂泰弘，山口庸子，峰野纯一，
申请(专利权)人：宝生物工程株式会社，
类型：发明
国别省市：日本,JP