本发明专利技术公开了一种Thermus脂肪酶的固定化方法：将氨基化纳米磁性载体Fe3O4/SiO2与pH8.0的缓冲溶液混合，加入质量浓度25%的戊二醛水溶液，室温下磁力搅拌4h，再加入以所述Tris-HCl缓冲溶液溶解的Thermus脂肪酶（Thermus?thermophilus?WL）的缓冲溶液，室温下磁力搅拌3.5h，磁分离，弃去上清液a，将沉淀a用缓冲溶液洗涤，冷冻干燥，获得固定化的Thermus脂肪酶；本发明专利技术所述固定化Thermus脂肪酶耐热范围40-100℃，pH值适应范围4.0-9.0，对金属离子，酶抑制剂及去污剂有较强的耐受性；具有极好的超顺磁性，易磁分离回收，较好的操作稳定性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种脂肪酶的固定化方法，特别涉及。
技术介绍
脂肪酶(lipase，EC3.1.1. 3)是一类特殊的酰基水解酶，能够在油-水界面上催化酯水解、酯合成、酯交换、内酯合成、多肽合成、高聚物合成及立体异构体拆分等化学反应。 迄今为止已分离提纯了来源于动植物和微生物的各种脂肪酶，目前被广泛研究的一种酶催化剂，被广泛地应用于洗涤剂、油脂与食品加工、有机合成、表面清洗、医药、化妆品、香料、 皮革与造纸工业、生物柴油的制备、油脂改性等方面的研究。Thermus脂肪酶是从深海热液口等高温环境中的嗜热微生物(>55°C )中分离得到的一类嗜热性脂肪酶，具有常规中温酶(20°C飞5°C )及低温酶(<20°C )无法比拟的优点， 由于嗜热酶的高温反应活性，以及对有机溶剂、去污剂和变性剂的较强抗性，使它在食品、 医药、制革、石油开采及生物柴油等方面都有广泛的应用潜力。但由于酶的价格昂贵、难以回收且在反应过程中易失活等原因，很大程度上限制了它在工业化生产中的应用。所谓酶的固定化，就是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。酶通过固定化后可以提高活力和稳定性，而且易于回收重复使用，因此酶固定化技术被广泛地应用，以降低生产成本、提高生产效率。
技术实现思路
本专利技术目的是提供，为热稳定嗜热酶类 (Mn-SOD)的固定化和应用提供一 种新的策略。本专利技术采用的技术方案是，所述方法为将氨基化纳米磁性载体Fe3O4/ SiO2与pH8. O的缓冲溶液混合，加入质量浓度25%的戊二醛水溶液，室温下磁力搅拌4h， 再加入以所述Tris-HCl缓冲溶液溶解的Thermus脂肪酶(Thermus thermophilus WL)的缓冲溶液，室温下磁力搅拌3. 5h，磁分离，弃去上清液a，将沉淀a用缓冲溶液洗涤，冷冻干燥，获得固定化的Thermus脂肪酶；所述Thermus脂肪酶按下述方法获得将序列号为 AAS81965.1的Thermus脂肪酶基因以大肠埃希氏杆菌(优选E. Coli BL21(DE3))为宿主细胞进行重组，获得含有Thermus脂肪酶基因的大肠埃希氏杆菌CGMCC NO :1. 12252 ;将含有 Thermus脂肪酶基因的大肠埃希氏杆菌CGMCC NO :1. 12252的单菌落接种于LB液体培养基中，37°C、250rpm培养4h，获得培养液a，取培养液a以体积分数1%的接种量接种于新鲜 LB液体培养基中，37°C、250rpm培养3h，获得培养液b，在培养液b中加入异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为O. 5mM, 37°C下培养4h，离心，将沉淀b加入pH7. 9的BufferA 缓冲液中，在IOKHz频率下进行超声裂解，离心，取上清液b进行Ni柱亲和层析，洗脱液经孔径7KDa的透析膜透析(MWC07kDa，ThermoSCIENTIFIC)后，取截留液冷冻干燥，获得所述Thermus脂肪酶。进一步，所述氨基化纳米磁性载体Fe304/Si02按如下方法制备(1)将氯化铁和氯化亚铁以物质的量之比3:2混合后，加水配制成混合液，在氮气氛围中，将混合液在30°C 下搅拌5min后，分别依次逐滴滴加质量浓度25%的氨水溶液a和聚乙二醇，滴加完毕后， 在60°C条件下继续通入氮气反应30min后，将反应液在53KHz下超声分散5min，室温下自然冷却至25°C后进行磁分离，取沉淀c用超纯水洗涤至中性后干燥，获得Fe3O4纳米颗粒； 所述水的体积用量以氯化铁和氯化亚铁中铁的总物质的量计为4600ml/mol ;所述氨水溶液a的体积用量以氯化铁和氯化亚铁中铁的总物质的量计为400ml/mol，所述聚乙二醇的体积用量以氯化铁和氯化亚铁中铁的总物质的量计为200ml/mol ;所述聚乙二醇的分子量为4000 ; (2)将Fe3O4纳米颗粒与无水乙醇、水和质量浓度25%的氨水溶液b混合，在53KHz 下进行超声分散lh，然后在室温下搅拌，同时缓慢滴加正硅酸乙酯，滴加完毕后室温反应 12h，反应完毕后，将反应液进行磁分离，沉淀d用蒸馏水洗涤至中性，再将洗涤后的沉淀 d在lmol/L的盐酸中室温浸泡12h，磁分离，去除盐酸后将沉淀e水洗至中性，干燥，获得 Fe304/Si02复合颗粒；所述无水乙醇、水的体积用量以Fe3O4纳米颗粒质量计分别为80ml/g、 20ml/g，所述的氨水溶液b体积用量以Fe3O4纳米颗粒质量及为2. 5ml/g ;所述正硅酸乙酯的体积用量以Fe3O4纳米颗粒质量计为1. 5ml/g ; (3)将Fe304/Si02复合颗粒加入无水乙醇中，在53KHz下超声分散Ih后，加入质量浓度25%的氨水溶液c继续在53KHz下超声分散 lOmin，然后通入氮气保护，在搅拌的条件下滴加3-氨丙基三乙氧基硅烷，同时在50°C反应 8h，反应结束后将反应液在室温下自然冷却至25°C，磁分离，沉淀用蒸馏水洗涤至中性，再用无水乙醇洗涤后干燥，获得所述氨基化纳米磁性载体Fe304/Si02 ;所述Fe304/Si02复合颗粒与无水乙醇、氨水溶液c和3-氨丙基三乙氧基硅烷的质量体积比分别为1:60、1 :6、1 :4。进一步,所述氨基化纳米磁性载体Fe304/Si02与pH8. O的缓冲溶液混合配制成载体终浓度10mg/mL的混合液。进一步，所述戊二醛水溶液的体积用量以氨基化纳米磁性载体Fe304/Si02质量计为 19.05ml/g。进一步，所述Thermus脂肪酶与氨基化纳米磁性载体Fe304/Si02的质量比为 O. 0925 lo更进一步，所述的Thermus脂肪酶的固定化方法推荐按如下步骤进行将氨基化纳米磁性载体Fe304/Si02与pH8. O的Tris-HCl缓冲溶液混合制成载体终浓度10mg/mL的混合液，再加入质量浓度25%的戊二醛水溶液，室温下磁力搅拌4h，然后加入Thermus脂肪酶的Tris-HCl缓冲溶液，室温下磁力搅拌3. 5h，磁分离，弃去反应液，将沉淀用pH8. O的 Tris-HCl缓冲溶液洗涤，冷冻干燥，获得所述固定化的Thermus脂肪酶；所述戊二醛水溶液的体积用量以氨基化纳米磁性载体？6304/5;102质量计为19. 05ml/g ;所述Thermus脂肪酶与氨基化纳米磁性载体Fe304/Si02的质量比为O. 0925 :1。本专利技术所述将序列号为AAS81965.1的Thermus脂肪酶基因(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)以大肠杆菌E. ColiBL21 (DE3)为宿主细胞进行重组，获得含有Thermus脂肪酶基因的大肠埃希氏杆菌，并于2012年6月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号CGMCC NO,1. 12252，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所。本专利技术所述的沉淀沉淀e均为沉淀，为便于区分不同步骤获得的沉淀不同而命名，所述培养液a和培养液b均为培养液，为便于区分不同步骤获得培养液不同而命名，所述氨水溶液a 氨水溶液c均为氨水溶液，为便于区分不同步骤加入的量不同而命名，字母本身没有含义。与现有技术相比，本专利技术有本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种Thermus脂肪酶的固定化方法，其特征在于所述方法为：将氨基化纳米磁性载体Fe3O4/SiO2与pH8.0的缓冲溶液混合，加入质量浓度25%的戊二醛水溶液，室温下磁力搅拌4h，再加入以所述Tris?HCl缓冲溶液溶解的Thermus脂肪酶（Thermus?thermophilus?WL）的缓冲溶液，室温下磁力搅拌3.5h，磁分离，弃去上清液a，将沉淀a用缓冲溶液洗涤，冷冻干燥，获得固定化的Thermus脂肪酶；所述Thermus脂肪酶按下述方法获得：将序列号为AAS81965.1的Thermus脂肪酶基因以大肠埃希氏杆菌为宿主细胞进行重组，获得含有Thermus脂肪酶基因的大肠埃希氏杆菌CGMCC?NO：1.12252；将含有Thermus脂肪酶基因的大肠埃希氏杆菌CGMCC?NO：1.12252的单菌落接种于LB液体培养基中，37℃、250rpm培养4h，获得培养液a，取培养液a以体积分数1%的接种量接种于新鲜LB液体培养基中，37℃、250rpm培养3h，获得培养液b，在培养液b中加入异丙基?β?D?硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为0.5mM，37℃下培养4h，离心，将沉淀b加入pH7.9的Buffer?A缓冲液中，在10KHz频率下进行超声裂解，离心，取上清液b进行Ni柱亲和层析，洗脱液经透析后，取截留液冷冻干燥，获得所述Thermus脂肪酶。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：章晓波，宋崇富，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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