本发明专利技术采用无皂乳液聚合制备的P(AM-co-St)-Ce(III)磁性高分子纳米微球，在此基础上通过共价键固定脂肪酶，属于脂肪酶固定化技术领域。本发明专利技术的优点是：①第一次将含铈磁性纳米粒子用于脂肪酶的固定；②固定脂肪酶后的磁性纳米微球具有优异的磁分离能力，铈离子对固定化脂肪酶有明显的激活作用；③脂肪酶被固定化后其pH值稳定性、热稳定性、操作稳定性、贮存稳定性均比自由酶明显提高；④固定化后的脂肪酶的米氏常数比游离酶下降，说明脂肪酶在固定化后其结合底物的能力有所增强；⑤固定化脂肪酶具有从反应体系中易分离和回收，可循环利用，而且操作简便从而降低企业成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及脂肪酶的固定化技术，属于脂肪酶固定化
技术介绍
酶是一种天然的高分子催化剂，催化效率极高、反应专一性强、来源广泛、无污染，在食品加工、医药等产业中有着极为广阔的应用。但天然酶稳定性差、易失活、 不能重复使用，并且反应后易混入产品，纯化困难，难以在工业中广泛的应用。此外，分离和提纯酶以及它们的一次性使用也大大增加了其作为催化剂的成本。为了克服这些问题，酶的固定化技术于20世纪60年代应运而生并发展起来，成为近几年酶工程研究的重点。固定化酶(Immobilized Enzyme)是通过物理的或化学的方法，将酶分子束缚在载体上，使其既保持酶的天然活性，又便于与反应液分离，可以重复使用，它是酶制剂中的一种新剂型。过去曾称其为水不溶酶或固相酶。1971年第一届国际酶工程会上正式建议采用固定化酶的名称。而作为固定化酶的一部分，载体材料的结构和性能对固定化酶的各种性能都有着巨大的影响。由于载体材料的重要性，因此自固定化酶技术兴起以来，很多学者就一直致力于对载体的研究。迄今为止，随着科学技术的发展，固定化酶的载体材料已从最初的天然高分子材料发展到合成高分子材料、无机材料，以及现在的复合材料等。复合载体材料是以有机材料和无机材料复合组成的新载体材料。如磁性纳米粒子与其它载体材料相比，磁性纳米粒子作为固定化载体具有从反应体系中易分离和回收、操作简便、成本较低等诸多优点，因此引起了国内外许多学者的广泛关注。脂肪酶是催化动植物油脂进行水解、酯交换反应一大类生物酶。脂肪酶催化反应条件温和，产物颜色浅，副产物少，且具有专一性，利于生产高质量单甘油酯、脂肪酸、甘油和其它种类油脂产物。但脂肪酶价格较高，且用游离脂肪酶进行反应时，脂肪酶只能使用一次而不能回收，因此造成产物成本较高，且导致后续分离步骤困难，影响利用脂肪酶水解和酯交换进行商业化生产。解决这一问题较好方法是对脂肪酶进行固定化，酶固定化是应用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有催化反应、并可回收及重复使用的一类技术。在酶固定化过程中，固定化酶性能取决于固定化酶所使用载体材料性质和固定化方法。如壳聚糖及其衍生物、纤维素及其衍生物、凝胶材料，有机合成聚合物、磁性粒子、无机材料、丝质和甲壳素等在酶固定化领域中应用。磁性纳米材料是指具有纳米量级超微粒构成固体物质。纳米材料具有如下结构特点(1)结构单元或特征维度尺寸在纳米数量级(I-IOOnm) ； (2)存在大量界面或自由表面； (3)各纳米单元之间存在一定相互作用；(4)磁性，可方便简单进行分离和磁性导向。由于纳米材料结构上特殊性，使纳米材料具有一些独特效应，主要表现为小尺寸效应和表面或界面效应，因而在性能上与相同组成微米材料有非常显著差异，体现出许多优异性能和全新功能，在酶固定化领域可望有广泛应用。与其它载体材料相比，磁性高分子微球作为固定化脂肪酶的载体具有诸多优点提高酶的稳定性，易于将酶与底物和产物分离；提高酶的生物相容性和免疫活性；操作简便，可降低成本；磁性载体固载酶放入磁场稳定的流动床反应器中，可以减少持续反应体系中的操作，适合于大规模连续化操作；利用外部磁场可以控制磁性材料固定化酶的运动方式和方向，替代传统的机械搅拌方式，提高固定化酶的催化效率。本专利技术的目的就是将含铈磁性纳米粒子用于共价固定脂肪酶，确定脂肪酶固定化的条件，使一定量的载体纳米粒子上所固定的脂肪酶的酶活力达到最大，并对比了固定化酶和游离酶的酶学特性。
技术实现思路
本专利技术的目的就是将含铈磁性纳米粒子用于共价固定脂肪酶，确定脂肪酶固定化的条件，使一定量的载体纳米粒子上所固定的脂肪酶的酶活力达到最大，并对比了固定化酶和游离酶的酶学特性。提供了一种新型的固定化脂肪酶，使脂肪酶的PH值稳定性、热稳定性、操作稳定性、贮存稳定性均比自由酶明显提高，固定化脂肪酶具有从反应体系中易分离和回收、操作简便从而使成本较低。本专利技术的技术方案一种含铈磁性纳米粒子用于脂肪酶的固定化技术，将脂肪酶直接加入牛乳中，酶的活性较低、半衰期短，酶只能使用一次，利用率低，导致生产成本较高，限制了半脂肪苷酶在乳制品工业中的应用。为克服这些问题，可通过物理的或化学的方法，将脂肪酶分子束缚在载体上，使其既保持酶的天然活性，又便于与反应液分离，并可以重复使用，即固定化脂肪酶。主要处理方法称取1. Og无皂乳液聚合制备的P(AM-C0-St)-Ce(III)磁性高分子纳米微球粉末于50mL三角烧瓶中，加入一定量含酶的缓冲液5mL，35°C条件下震荡(120r/ min)反应30h，离心直到上清液中脂肪酶的偶联率大于95%，抽滤，用5°C的去离子水洗涤， 得到固定化脂肪酶。根据固定化脂肪酶磁性粒子的沉降时间，考察纳米磁性粒子的磁分离性能。根据固定化酶的偶联率和活力回收的影响，确定了纳米微球粒径，铈的质量分数以及给酶量。根据酶的活性确定了固定化脂肪酶的pH值稳定性、热稳定性、操作稳定性范围。所述纳米磁性粒子的磁分离性能固定脂肪酶后的磁性纳米微球具有优异的磁分离能力，在缓冲液中，磁沉降速度是重力沉降的15倍；在正己烷中，磁沉降速度是重力沉降的60倍。所述纳米微球粒径对偶联率和活力回收的影响随着微球直径的增加，固定化酶的偶联率逐渐减小，活力回收也逐渐减小。所述铈的质量分数对偶联率和活力回收的影响微球表面铈纳米粒子质量分数为 1. 时，固定化酶的偶联率和活力回收为96%和74%。所述给酶量对偶联率和活力回收的影响随着给酶量的增加，固定化酶的偶联率逐渐减小，活力回收也逐渐减小，但在给酶量80mg/g时，酶的活力回收仍高达60%。所述固定化脂肪酶的PH值稳定性、热稳定性、操作稳定性范围固定化脂肪酶在 PH值6-9范围内均保持较高的活性；最适反应温度为50°C，比游离酶的最适反应温度高了 IO0C ；固定化脂肪酶反复使用7次后，酶活仍保持了 75%以上。本专利技术的有益效果第一次将含铈磁性纳米粒子用于脂肪酶的固定化技术，可以提高脂肪酶的活性， 延长半衰期，由于固定化酶可以循环利用，从而提高了酶的利用率，降低了企业的生产成本。固定化后的脂肪酶有了更宽的PH适用范围，热稳定性得到明显提高，最适反应温度达到50°C，固定化脂肪酶反复使用7次后，酶活仍保持了 75%以上；同时铈离子对固定化脂肪酶有明显的激活作用，当铈离子质量分数为1. 时，固定化酶的偶联率和活力回收为 96%和 74%。附图说明附图为含铈磁性纳米粒子固定化脂肪酶的工艺流程示意图。 具体实施例方式实施例1 以含铈磁性纳米粒子固定磷脂酶A1采用无皂乳液聚合制备P (AM-co-St)-Ce (III)磁性高分子纳米微球，然后通过共价键固定磷脂酶A115具体实施方法本专利技术的主要过程为称取1. Og含铈磁性纳米粒子粉末于50mL三角烧瓶中，加入一定量含酶的缓冲液5mL，35°C条件下震荡(120r/min)反应30h， 离心直到上清液中脂肪酶的偶联率大于95%，抽滤，用5°C的去离子水洗涤，得到固定化磷脂酶、。其中微球表面铈纳米粒子质量分数为1. 1%，随着含酶缓冲液中的给酶量的增加， 固定化酶的偶联率逐渐减小，活力回收也逐渐减小，控制给酶量在30mg/g-70mg/g之间。固定磷脂酶A1后的磁性纳米微球具有优异的磁分离能力，在缓本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种含铈磁性纳米粒子用于脂肪酶的固定化技术，主要过程为称取１．０ｇ含铈磁性纳米粒子粉末于５０ｍＬ三角烧瓶中，加入一定量含酶的缓冲液５ｍＬ，３５℃条件下震荡（１２０ｒ／ｍｉｎ）反应３０ｈ，离心直到上清液中脂肪酶的偶联率大于９５％，抽滤，用５℃的去离子水洗涤，得到固定化脂肪酶，并对纳米粒子进行了磁性分析，确定了纳米微球粒径、铈的质量分数、给酶量对固定化酶偶联率和活力回收的影响，和酶活的ｐＨ值稳定性、热稳定性、操作稳定性范围。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张晖，张艳杰，郭晓娜，钱海峰，王立，齐希光，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32
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