固定化酶膜的制备方法技术

固定化酶膜的制备方法，它涉及一种固定化酶的制备方法。本发明专利技术解决了现有方法制作得到的固定化酶膜的酶蛋白承载量低以及催化活性低的问题。方法：一、制备甲基丙烯酸甲酯接枝膜；二、制备吸附有己二胺的甲基丙烯酸甲酯接枝膜；三、将吸附有己二胺的甲基丙烯酸甲酯接枝膜浸入到地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶溶液或转谷氨酰胺酶溶液中进行处理即得到固定化酶膜。本发明专利技术制作得到的固定化酶膜的酶蛋白承载量好，本发明专利技术制作得到的固定化酶膜的地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶的承载量大于３５ｍｇ／ｇ膜，谷氨酰胺酶的承载量大于２０ｍｇ／ｇ膜。本发明专利技术方法制作得到的固定化酶膜的吸附能力、催化活性以及热稳定性好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种固定化酶的制备方法。
技术介绍
固定化酶是用一定的材料将活性酶束缚或限制于一定的区域内，但仍能进行酶所特有的催化反应，并可回收及重复使用的一种新技术。与水溶酶相比，固定化酶在保持其高效、专一、温和及酶的活性可调节控制等酶催化反应特性以外，还有分离回收容易、可重复多次使用、操作连续及可控、工艺简便等系列优点，因此在生物及生物工程、医药、食品、医学及生命科学等相关领域得以迅速发展。 从上世纪50年代膜分离技术进入工业化以来，经过几十年的发展，它已广泛渗透到化工、冶金、环保、生物工程领域。分离膜不仅能够对气体、有机物、各类生物制剂等进行有效的分离、浓縮和纯化，而且还成为了固定化酶的载体。固定化酶膜能够将酶的催化特性和膜的优良分离性能有机地结合起来，从而构成酶膜生物反应器。微孔膜是具有无数互通微孔(孔径一般为0.01 10iim)的薄膜，其基材可为聚烯烃、聚醚矾、聚氨醋等。在上述基材中，聚丙烯具有高熔点、高耐热性等优异性能，且聚丙烯材料价格低廉，因而聚丙烯材料制成的微孔膜得到了广泛应用。现有利用聚丙烯材料制作固定化酶膜制作方法有物理法和化学法俩大类，物理法的优点在于酶不参加化学反应，整体结构保持不变，酶的催化活性得到很好保留，但是，该方法制作得到的固定化酶膜上的酶蛋白的承载量较低，仅为15mg/g膜左右，酶蛋白的承载量较低，影响了固定化酶膜的使用；化学法是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上，使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来，而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法，但是，该法在制作过程对酶活性基团破坏严重，极大的降低了酶的催化活性，该所制作得到的固定化酶膜催化活性低，极大的限制了固定化酶膜在实际中的应用。
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有方法制作得到的固定化酶膜的酶蛋白承载量低以及催化活性低的问题，而提供了。 本专利技术按照以下步骤进行一、聚丙烯膜在丙酮中浸泡22 26h，然后在25 35。C条件下干燥22 26h后放入浓度为0. 2mol/L 二苯甲酮的丙酮溶液中，在氮气保护下用紫外光照射14 16min，紫外光照射强度为90 110y W/cm2，照射距离11 13cm，再将膜自然晾干后浸入质量浓度为10% 30%的甲基丙烯酸甲酯的乙醇溶液中，在28 32t:条件下水浴振荡22 26h，然后在28 32。C的条件下真空干燥22 26h即得到甲基丙烯酸甲酯接枝膜，其中甲基丙烯酸甲酯的乙醇溶液的溶剂是质量浓度为90% 99%的乙醇；二、甲基丙烯酸甲酯接枝膜浸入到质量浓度为13% 17%的己二胺溶液中，在45 55t:条件下振荡35 45min 用去离子水清洗得到了吸附有己二胺的甲基丙烯酸甲酯接枝膜；三、4. 5 5. 5g的地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶或4. 5 5. 5g的转谷氨酰胺酶溶解于480 520ml、浓度为0. 05mol/L、pH为6. 0的磷酸盐缓冲溶液中得到地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶溶液或转谷氨酰胺酶溶液，然后将吸附有己二胺的甲基丙烯酸甲酯接枝膜浸入到地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶溶液或转谷氨酰胺酶溶液中，在3. 8 4. 2t:条件下反应23 25h，用浓度为0. 05mol/L、 pH为6. 0的磷酸盐缓冲溶液清洗后即得到了固定化酶膜。 本专利技术以聚丙烯微孔膜为载体，采用紫外光照射引发接枝甲基丙烯酸羟乙酯的固定化方法对地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶和微生物转谷氨酰胺酶进行固定化。本实施方式中所使用的甲基丙烯酸羟乙酯的结构为，由于甲基丙烯酸羟乙酯的结构中含有多个羟基，在紫外光照射后可以给后续的酶的固定化提供了更多的结合位点，且在酶固定化过程中添加了多羟基化合物作为保护剂，大大减弱了戊二醛对酶活性基团如羧基和丝氨酸羟基等的破坏作用，大大提高本专利技术的固定化酶膜的酶蛋白承载量，保证了酶的催化活性不变。本专利技术制作得到的固定化酶膜的地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶的承载量大于35mg/g膜，谷氨酰胺酶的承载量大于20mg/g膜，与现有方法相比较蛋白酶承载提高了 10%以上，本专利技术制作得到固定化酶膜的酶蛋白承载量高，且本专利技术方法制作得到的固定化酶膜催化活性好，与现有方法制作得到的固定化酶膜相比较本专利技术制作得到的固定化酶膜的催化活性提高了 20%左右，本专利技术方法制作得到的固定化酶膜的吸附能力以及热稳定性好。具体实施例方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一 本实施方式按照以下步骤进行一、聚丙烯膜在丙酮中浸泡22 26h，然后在25 35t:条件下干燥22 26h后放入浓度为0. 2mol/L二苯甲酮的丙酮溶液中，在氮气保护下用紫外光照射14 16min，紫外光照射强度为90 110iiW/cm、照射距离11 13cm，再将膜自然晾干后浸入质量浓度为10% 30%的甲基丙烯酸甲酯的乙醇溶液中，在28 32t:条件下水浴振荡22 26h，然后在28 32t:的条件下真空干燥22 26h即得到甲基丙烯酸甲酯接枝膜，其中甲基丙烯酸甲酯的乙醇溶液的溶剂是质量浓度为90% 99%的乙醇；二、甲基丙烯酸甲酯接枝膜浸入到质量浓度为13% 17%的己二胺溶液中，在45 55t:条件下振荡35 45min后用去离子水清洗得到了吸附有己二胺的甲基丙烯酸甲酯接枝膜；三、4. 5 5. 5g的地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶或4. 5 5. 5g的转谷氨酰胺酶溶解于480 520ml、浓度为0. 05mol/L、pH为6. 0的磷酸盐缓冲溶液中得到地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶溶液或转谷氨酰胺酶溶液，然后将吸附有己二胺的甲基丙烯酸甲酯接枝膜浸入到地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶溶液或转谷氨酰胺酶溶液中，在3. 8 4. 2。C条件下反应23 25h，用浓度为0. 05mol/L、pH为6. 0的磷酸盐缓冲溶液清洗后即得到了固定化酶膜。 本实施方式步骤一的二苯甲酮的丙酮溶液中丙酮为溶剂，二苯甲酮为溶质。 本实施方式制作得到的固定化酶膜的地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶的承载量大于 35mg/g膜，谷氨酰胺酶的承载量大于20mg/g膜，与现有方法制作得到的固定化酶膜相比较 蛋白酶承载提高了 10%以上，本实施方式制作得到固定化酶膜的酶蛋白承载量高，且本发 明方法制作得到的固定化酶膜催化活性好，与现有方法制作得到的固定化酶膜相比较本实 施方式制作得到的固定化酶膜的催化活性提高了20%左右。本专利技术方法制作得到的固定化 酶膜的吸附能力以及热稳定性好。 本实施方式制作得到的固定化酶膜可以应用在大豆蛋白的分离制备中，所分离得 到的大豆蛋白纯度和分散性好，大豆蛋白的分子结构完整性好。具体实施方式二 本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一中聚丙烯膜在 丙酮中浸泡24h。其它步骤及参数与具体实施方式一相同。具体实施方式三本实施方式与具体实施方式一至二不同的是步骤一中在30°C 条件下干燥24h。其它步骤及参数与具体实施方式一至二相同。具体实施方式四本实施方式与具体实施方式一至三不同的是步骤一中用紫外 光照射15min，紫外光照射强度为100iiW/cm、照射距离12cm。其它步骤及参数与具体实施 方式一至三相同。具体实施方式五本实施方式与具体实施方式一至四不同的是步骤二中在50°C 条件下振荡40min。其它步骤及本文档来自技高网...

【技术保护点】
固定化酶膜的制备方法，其特征在于固定化酶膜的制备方法按照以下步骤进行：一、聚丙烯膜在丙酮中浸泡２２～２６ｈ，然后在２５～３５℃条件下干燥２２～２６ｈ后放入浓度为０．２ｍｏｌ／Ｌ二苯甲酮的丙酮溶液中，在氮气保护下用紫外光照射１４～１６ｍｉｎ，紫外光照射强度为９０～１１０μＷ／ｃｍ↑［２］，照射距离１１～１３ｃｍ，再将膜自然晾干后浸入质量浓度为１０％～３０％的甲基丙烯酸甲酯的乙醇溶液中，在２８～３２℃条件下水浴振荡２２～２６ｈ，然后在２８～３２℃的条件下真空干燥２２～２６ｈ即得到甲基丙烯酸甲酯接枝膜，其中甲基丙烯酸甲酯的乙醇溶液的溶剂是质量浓度为９０％～９９％的乙醇；二、甲基丙烯酸甲酯接枝膜浸入到质量浓度为１３％～１７％的己二胺溶液中，在４５～５５℃条件下振荡３５～４５ｍｉｎ后用去离子水清洗得到了吸附有己二胺的甲基丙烯酸甲酯接枝膜；三、４．５～５．５ｇ的地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶或４．５～５．５ｇ的转谷氨酰胺酶溶解于４８０～５２０ｍｌ、浓度为０．０５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ为６．０的磷酸盐缓冲溶液中得到地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶溶液或转谷氨酰胺酶溶液，然后将吸附有己二胺的甲基丙烯酸甲酯接枝膜浸入到地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶溶液或转谷氨酰胺酶溶液中，在３．８～４．２℃条件下反应２３～２５ｈ，用浓度为０．０５ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ为６．０的磷酸盐缓冲溶液清洗后即得到了固定化酶膜。...

【技术特征摘要】
固定化酶膜的制备方法，其特征在于固定化酶膜的制备方法按照以下步骤进行一、聚丙烯膜在丙酮中浸泡22～26h，然后在25～35℃条件下干燥22～26h后放入浓度为0.2mol/L二苯甲酮的丙酮溶液中，在氮气保护下用紫外光照射14～16min，紫外光照射强度为90～110μW/cm2，照射距离11～13cm，再将膜自然晾干后浸入质量浓度为10％～30％的甲基丙烯酸甲酯的乙醇溶液中，在28～32℃条件下水浴振荡22～26h，然后在28～32℃的条件下真空干燥22～26h即得到甲基丙烯酸甲酯接枝膜，其中甲基丙烯酸甲酯的乙醇溶液的溶剂是质量浓度为90％～99％的乙醇；二、甲基丙烯酸甲酯接枝膜浸入到质量浓度为13％～17％的己二胺溶液中，在45～55℃条件下振荡35～45min后用去离子水清洗得到了吸附有己二胺的甲基丙烯酸甲酯接枝膜；三、4.5～5.5g的地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶或4.5～5.5g的转谷氨酰胺酶溶解于480～520ml、浓度为0.05mo...

【专利技术属性】
技术研发人员：马永强，石彦国，杨春华，张毅方，刘颖，
申请(专利权)人：哈尔滨商业大学，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]