本发明专利技术提供了一种硫酸铵促进Eupergit?C?250固定化草酸脱羧酶的方法，属于生物化工技术领域。本发明专利技术包括：重组草酸脱羧酶的诱导表达，亲和层析分离纯化草酸脱羧酶及草酸脱羧酶固定化三部分。其特征在于：使用含活性环氧基的Eupergit?C?250为固定化载体，在固定化过程中添加0.1-2mol/L的中性盐硫酸铵，促进载体对草酸脱羧酶的吸附和共价连接反应。本发明专利技术操作简单，酶活回收达到84％以上；使用载体材料价格适中，物化性能稳定，制备的固定化酶具有较好的操作性能、易于回收重复使用，可应用于食品或造纸等工业过程中草酸的降解。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物化工
，特别是提供了。
技术介绍
草酸脱羧酶(EC 4.1.1.2)催化转化草酸为甲酸和C02，是生物体内催化降解草酸及草酸盐的三种酶之一，对底物草酸具有较强的专一性。草酸脱羧酶已被应用于高草酸尿、尿石症等临床医疗检测，其在食品、工业等领域也具有广阔的应用前景。将草酸脱羧酶应用于啤酒工业中可控制和降解富含草酸盐的啤酒石；用于氧化铝冶炼工业中可以高效处理生产过程的草酸废弃物；用于造纸制浆过程可降低在流程管路、过滤器或换热器等设备上草酸盐的结垢风险(曹茂新等，草酸脱羧酶及其应用，中国生物工程杂志， 2005(增)170-175)。草酸脱羧酶主要存在于木材腐败真菌中，如漆斑菌(Myrothecium Verrucari)、金针 (Flammulina velutipes)、黑曲霉(Aspergillus niger)、双抱蘑 (Agaricus bisporus)等，细菌中枯草杆菌(Bacillus subtil is)的草酸脱羧酶研究报道较多。目前草酸脱羧酶的制备有两种方法一是对高产的野生菌进行酸诱导发酵，产酶水平约在 20U/L 左右 Oiu CX 等，Induction of an Oxalate decarboxylase in the Filamentous Fungus Trametes versicolor by Addition of Inorganic Acids, Appl Biochem Biotechnol, 2010,160 (2) :655-664) ；二是构建草酸脱羧酶的转基因工程菌进行高效诱导合成，产酶水平约为820U/g(wet weight)。总体看，目前草酸脱羧酶的生产制备成本比较高，这直接限制了其在各种工业过程的应用。酶固定化是降低酶催化成本、提高酶稳定性的有效方法。目前已有结晶交联固定化草酸脱羧酶的方法(结晶化的草酸脱羧酶和使用方法，中国专利公开号CN 101583375A)，但存在固定化过程必须首先实现酶的结晶、固定化酶粒度难以控制等问题， 获得的结晶交联固定化草酸脱羧酶操作性能差，仅适合于制作口服酶制剂而不适用于工业降解草酸的操作条件。通过共价连接将酶固定于树脂等载体上可以有效地改善固定化酶的的操作性能；合理控制固定化反应条件，实现酶与载体间的多点共价连接，还可以有效稳定多聚体酶的四级结构，这对于维持草酸脱羧酶六聚体结构的稳定性与活性非常重要。聚丙烯酸载体C(Eupergit C)，直径约100-250 μ m，具有化学、机械性能稳定；可长期存放；具有较高的反应活性，可以和蛋白质上的氨基、巯基、羟基等基团反应形成稳定多点共价键；固定化后未反应的环氧基团易于使用巯基乙醇或二硫苏糖醇进行封闭等优点，是酶固定化常用的商品化载体(Ephraim KK 等 Eupergit C, a carrier for immobilization of enzymes of industrial potential, Journal of Molecular Catalysis B :Enzymatic 10,2000. 157-176)，目前已成功应用于青霉素酰胺酶、环状糊精葡萄糖基转移酶、磷酸二酯酶、脂肪酶等多种工业酶的固定化。使用Eupergit C固定化酶反应历程需经过吸附和共价反应两步。由于Eupergit C表面具有较强的疏水性，而酶的亲水性一般较强，因此需通过提高缓冲液的浓度促进载体对酶的吸附，加快固定化的反应历程以减少固定化造成的酶活损失。而一些缓冲对价格比较高，提高缓冲液浓度的方法必将大幅增加固定化反应的成本。 此外，利用Eupergit C固定化草酸脱羧酶用于流体中草酸及草酸盐降解迄今未见报道。
技术实现思路
本专利技术目的是提供，该方法操作简单，制备所得固定化草酸脱羧酶酶活可达410U/g，酶活回收达84%以上。制备所得固定化草酸脱羧酶可用于工业或食品中草酸及草酸盐的降解。本专利技术的技术方案。 包括草酸脱羧酶的诱导表达，亲和层析分离纯化草酸脱羧酶，草酸脱羧酶固定化三部分。工艺步骤如下(1)重组草酸脱羧酶的诱导表达将产草酸脱羧酶基因工程菌E. coli BL21(DE;3)/pET32a/YVrK进行发酵培养。当细菌生长至0D600为0. 4时，42°C热冲击5min，加人MnCl2及IPTG诱导草酸脱羧酶表达，离心收集菌体，磷酸盐缓冲液重悬菌体后进行超声破碎细菌，离心收集上清为粗酶液。(2)亲和层析分离纯化草酸脱羧酶使用AKTA-FPLC系统进行酶纯化。粗酶液过0. 2um孔径膜后上柱(5mL HisTrap HP)，调节洗脱液中咪唑浓度进行洗脱，将草酸脱羧酶与其他杂质分离。分级酶液利用 SDS-PAGE进行分析鉴定。有活性的纯化酶液经超滤浓缩、PD-10柱脱盐，获得纯化的草酸脱羧酶。(3)草酸脱羧酶固定化Eupergit C 250首先使用50mmol/L磷酸盐缓冲液浸泡溶胀，加入纯化草酸脱羧酶，加入硫酸铵使之浓度达0. l-2mol/L，在pH7-10、20-30°C下，以30_200rpm的转速振荡固定化反应4-72h。离心弃去上清，加入5%巯基乙醇封闭剩余环氧基团，反应1 后过滤，用缓冲液洗涤，冲洗巯基乙醇及未固定上的游离酶，直至洗出液中无酶活性，即得固定化草酸脱羧酶，4°C用缓冲液保存待用。游离草酸脱羧酶活性测定草酸脱羧酶活力测定采用终止反应法。反应液含 0. 115mol/L草酸钾，80μπκ)1/1 MnCl2, 50mmol/L pH4. 0柠檬酸缓冲液，加入草酸脱羧酶液开始反应，IOmin后加入等体积的0. 2mol/L磷酸氢二钾使体系pH上升至7. 2终止反应。 过0.20 μ m微孔膜除去酶蛋白，采用液相色谱法(HPLC)检测反应生成的甲酸。色谱柱为 Aminex resin-based 87H 柱，柱温 65°C ；流动相为 0. 004mol/LH2S04，流速 0. 6mL/min ；紫外检测器210nm检测；进样量20 μ L。酶活单位定义为每分钟催化转化草酸产生1 μ mol 甲酸的酶量。固定化草酸脱羧酶活性测定方法同游离草酸脱羧酶酶活测定方法，反应在120rpm 震荡条件下进行。固定化酶活回收率回收的固定化酶的酶活力与用于固定化的酶的总活力之比。本专利技术的优点在于①利用成熟的固定化载体Eupergit C 250固定化草酸脱羧酶，利于草酸脱羧酶的回收及重复使用，提高酶对温度等影响因子的稳定性，克服了草酸脱羧酶应用中成本较高的问题，同时改善了固定化草酸脱羧酶应用中的操作性能；②应用添加中性盐硫酸铵促进Eupergit C 250固定化草酸脱羧酶，提高了酶的固定化效率，操作简单，成本低。具体实施方式为了更好的理解本专利技术，下面结合实施例子对本专利技术做进一步的描述。实例1 (1)重组草酸脱羧酶的诱导表达将基因工程菌E. coli BL21 (DE3)/pET32a/YvrK接于含氨苄青霉素(0. lmg/ml)的 LB培养基中37°C，200r/min进行培养。细菌生长至0D600为0. 4时，42°C热冲击5min，将温度降回37°C，加人MnCl2至终浓度为5mmol/L，IPTG终浓度至0. 4mmo本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种硫酸铵促进Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ ２５０固定化草酸脱羧酶的方法，包括重组草酸脱羧酶的诱导表达，草酸脱羧酶的纯化，以及固定化草酸脱羧酶的步骤；其特征在于：使用含活性环氧基的Ｅｕｐｅｒｇｉｔ Ｃ ２５０为固定化酶载体。
【技术特征摘要】
1.一种硫酸铵促进Eupergit C 250固定化草酸脱羧酶的方法，包括重组草酸脱羧酶的诱导表达，草酸脱羧酶的纯化，以及固定化草酸脱羧酶的步骤；其特征在于使用含活性环氧基的Eupergit C 250为固定化酶载体。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于使...
【专利技术属性】
技术研发人员：林日辉，
申请(专利权)人：广西民族大学，
类型：发明
国别省市：45
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