本发明专利技术公开了一种塔宾曲霉发酵生产果胶酯酶的方法，包括以下步骤：将塔宾曲霉接种于培养基中，发酵培养后获得含果胶酯酶发酵液，分离含果胶酯酶发酵液获得果胶酯酶。所述培养基组成为高酯果胶3% (w/v)，硫酸铵0.5% (w/v)，Na2SO4 0.04% (w/v)，MgSO4·7H2O 0.04% (w/v)，K2HPO4 0.2% (w/v)，FeSO4·7 H2O 0.005%(w/v)，100 mL蒸馏水。所述分离含果胶酯酶发酵液的步骤包括：将发酵完毕的含果胶酯酶的发酵液，于4℃，10000 rpm离心15 min，上清液经过滤除菌、硫酸铵沉淀、离心、透析脱盐后得到果胶酯酶酶液。本发明专利技术首次采用了塔宾曲霉发酵生产果胶酯酶，开辟了微生物产果胶酯酶的新道路，并且与固态发酵法相比，液态发酵具有易实现自动化连续生产，生产过程易控制，生产规模大等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及果胶酯酶，特别涉及一种塔宾曲霉发酵生产果胶酯酶的方法。
技术介绍
果胶酯酶（PE）又名果胶甲酯酶(pectinesterase,PE,EC3.1.1.11)，是一种专一催化果胶分子长链上甲酯基水解，生成低酯果胶的一种酶。它不会减小果胶聚合物的体积，能较好地保持产品的胶凝度。果胶酯酶可用于果汁的制备，能改善过滤效果，有效提高出汁率，加速澄清效率等。研究表明，在一些蔬菜的加工中，果蔬组织中存在的果胶酯酶能保护果蔬质构。果胶酯酶能使果蔬中形成更大的果胶聚合物，使食物的青脆度近于新鲜。除用于果蔬保藏以外，高度专一的PE还可以用于研究酶的行为模式、果胶结构和功能性质之间的基本关系以及制备低酯果胶。果胶酯酶可从高等植物的果实和微生物中获得。其中，微生物果胶酯酶来源极其广泛，包括细菌、真菌、放线菌等。随着果胶酯酶来源不同，其理化特征等方面亦有差异。Ishii等发现从黑曲霉中提取的PE随机水解果胶分子中的甲酯，获得的低酯果胶胶凝性优于由其他材料来源的PE制备的低酯果胶。2004年，焦云鹏等人利用从黑曲霉发酵液中提取的果胶酯酶进行脱酯制备低酯果胶。帝斯曼公司研究发现，其果胶酯酶产品Rapidase.FPSuper加入草莓整果中，草莓的硬度和稳定性都显著增强。国内未有生产果胶酯酶的公司,国外主要有诺维信、Sigma、帝斯曼等公司,产品形式为液体和粉末。工业上果胶酯酶主要是从黑曲霉发酵液中获得，而目前对利用塔宾曲霉发酵获得果胶酯酶尚未有报道。果胶酯酶在生产上的应用已有40多年的历史，采用固态法进行生产，以商品制剂出售。随着我国人民生活水平的提高，对外贸易的发展，低酯果胶的需求量越来越大，但至今仍需从国外进口，故对果胶酯酶的需求日益迫切。有鉴于此，本专利技术人研究和设计了一种塔宾曲霉发酵生产果胶酯酶的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种塔宾曲霉发酵生产果胶酯酶的方法。一种塔宾曲霉发酵生产果胶酯酶的方法，包括以下步骤：将塔宾曲霉菌种CICC2651接种于培养基中，180rpm，30℃培养4d，发酵培养后获得含果胶酯酶发酵液，分离纯化含果胶酯酶发酵液获得果胶酯酶。作为实施例的优选方式，所述培养基为3%(w/v)高酯果胶、0.5%(w/v)(NH4)2SO4、0.04%(w/v)MgSO4·7H2O、0.2%(w/v)K2HPO4、0.04%(w/v)Na2SO4、0.005%(w/v)FeSO4·7H2O，100mL蒸馏水。作为实施例的优选方式，所述发酵培养的条件为初始pH4.5，培养温度30℃，接种量5%(OD600=2.0)，180rpm，250mL三角瓶装液量40mL，培养时间为4d。作为实施例的优选方式，所述分离纯化含果胶酯酶发酵液的步骤包括：将发酵完毕的含果胶酯酶的发酵液，经过4℃，10000rpm，离心15min，获取上清液即为粗酶液；将所得粗酶液进行过滤除菌，然后向粗酶液中加入固体硫酸铵至饱和度70%，充分溶解后在高速冷冻离心机中4℃，10000rpm离心15min，弃沉淀；上清再用硫酸铵沉淀至饱和度100%，充分溶解后于4℃，10000rpm离心15min，弃上清，取沉淀用蒸馏水溶解；再用适量蒸馏水于4℃中透析，每隔4h换透析液，收集透析液得果胶酯酶。本专利技术首次采用了塔宾曲霉发酵生产果胶酯酶，开辟了微生物产果胶酯酶的新道路，并且与固态发酵法相比，液态发酵具有易实现自动化连续生产，生产过程易控制，生产规模大等优点。附图说明图1为不同碳源对产酶的影响图；在图1中，横坐标为不同的碳源，纵坐标为生物量（g/L）和果胶酯酶酶活（U/mL）；图2为高酯果胶浓度对产酶的影响图；在图2中，横坐标为高酯果胶浓度（w/v，%），纵坐标为果胶酯酶酶活（U/mL）；图3为不同氮源对产酶的影响图；在图3中，横坐标为不同的氮源，纵坐标为生物量（g/L）和果胶酯酶酶活（U/mL）；图4为硫酸铵浓度对产酶的影响图；在图4中，横坐标为硫酸铵浓度（w/v，%），纵坐标为生物量（g/L）和果胶酯酶酶活（U/mL）；图5为无机盐浓度NaSO对产酶的影响图；在图5中，横坐标为无机盐浓度（w/v，%），纵坐标为生物量（g/L）和果胶酯酶酶活（U/mL）；图6为无机盐浓度MgSO4对产酶的影响图；在图6中，横坐标为无机盐浓度（w/v，%），纵坐标为生物量（g/L）和果胶酯酶酶活（U/mL）；图7为无机盐浓度K2HPO4对产酶的影响图；在图7中，横坐标为无机盐浓度（w/v，%），纵坐标为生物量（g/L）和果胶酯酶酶活（U/mL）；图8为优化前后生物量（g/L）及酶活(U/mL)变化图；图9为硫酸铵分级沉淀对果胶酯酶的影响图。具体实施方式为使本领域的技术人员能进一步了解本专利技术，下面列举本专利技术的具体实施例，并配合说明书附图，详细说明本专利技术的技术方案。需强调的：实施例并非本专利技术技术方案所有可能实施方式的穷举，故不用于限制本专利技术的保护范围。实施例中未注明具体技术或条件，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。下述实施例中的培养基通过以下方法制备：（1）材料与方法菌种：塔宾曲霉CICC2651(Aspergillustubingensis)由本实验室筛选所得，并保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC），本领域技术人员可通过公众途径购买获得。（2）培养基PDA斜面培养基：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000mL煮沸半个小时，纱布过滤，滤液再加20g葡萄糖和20g琼脂继续煮沸，充分溶解后分装试管，每试管约5mL，121℃灭菌20min后取出试管摆斜面，冷却后贮藏备用。（3）发酵培养基称取3%高酯果胶、0.5%(w/v)(NH4)2SO4、0.04%(w/v)MgSO4·7H2O、0.2%(w/v)K2HPO4、0.04%(w/v)Na2SO4、0.005%(w/v)FeSO4·7H2O，充分溶解于100mL蒸馏水中，调节初始pH为4.5，分装40mL上述溶液于250mL三角瓶中，121℃灭菌20min。（4）主要试剂1)0.02mol/LNaOH溶液:准确称取0.8gNaOH用蒸馏水溶解，并定容至1L；2)1%高酯果胶溶液：称取1g高酯果胶溶于100mL蒸馏水中，调pH至4.5。（5）试验方法单孢子菌悬液的制备：将4℃下贮藏的菌种，用无菌蒸馏水洗下孢子，放到装有无菌玻璃珠的锥形瓶中，充分振荡30min。待孢子充分打散后，测菌悬液OD600，并用无菌生理盐水调整其OD600至2.0，即得单孢子菌悬液。（6）塔宾曲霉发酵生产果胶酯酶发酵培养基配好后，121℃灭菌20min，冷却后在无菌条件下接种5%塔宾曲霉孢子悬液(OD600=2.0)，混匀后置于30℃恒温振荡器中，180rpm，培养4d。（7）粗酶液提取取出恒温培养振荡器中已培养4d含果胶酯酶的发酵液，在4℃，10000rpm下离心15min，取上清液即为粗酶液。（8）果胶酯酶活力的测定取100ml1%高酯果胶溶液（pH4.5）于55℃下恒温，加入10ml粗酶液，记录初始混合液pH，反应进行10min，记录混合液pH。滴入0.02mo本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种塔宾曲霉发酵生产果胶酯酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：将塔宾曲霉菌种CICC 2651接种于培养基中，180 rpm，30℃培养4 d，发酵培养后获得含果胶酯酶发酵液，分离纯化含果胶酯酶发酵液获得果胶酯酶。
【技术特征摘要】
1.一种塔宾曲霉发酵生产果胶酯酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：将塔宾曲霉菌种CICC2651接种于培养基中，180rpm，30℃培养4d，发酵培养后获得含果胶酯酶发酵液，分离纯化含果胶酯酶发酵液获得果胶酯酶。2.如权利要求1所述的一种塔宾曲霉发酵生产果胶酯酶的方法，其特征在于：所述培养基为3%(w/v)高酯果胶、0.5%(w/v)(NH4)2SO4、0.04%(w/v)MgSO4·7H2O、0.2%(w/v)K2HPO4、0.04%(w/v)Na2SO4、0.005%(w/v)FeSO4·7H2O，100mL蒸馏水。3.如权利要求1所述的一种塔宾曲霉发酵生产果胶酯酶的方法，其特征在于：所述发酵培养的条件为初始pH4.5，...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖安风，田友明，蔡慧农，倪辉，吴昌正，杨秋明，肖琼，翁惠芳，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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