本发明专利技术公开了一种基于阳离子交换膜的酶固定化方法及酶微反应器，属于蛋白质酶解技术领域。以阳离子交换膜作为酶固定化的载体，实现该方法的酶微反应器的核心组件-反应腔由第一和第二阳离子交换膜(1)、(3)和聚醚醚酮薄膜(2)组成，聚醚醚酮薄膜(2)夹在第一和第二阳离子交换膜(1)和(3)之间。聚醚醚酮薄膜(2)上刻蚀的微通道(4)穿透聚醚醚酮薄膜(2)的上下表面。酶溶液连续通过酶微反应器2-10分钟即可完成酶固定化过程，酶通过静电作用和疏水作用固定在阳离子交换膜上。蛋白质溶液连续通过酶微反应器，在数秒内即可完成酶解。酶微反应器在每一次酶解后快速再生，完全避免了不同蛋白质酶解结果的干扰。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于蛋白质酶解
，具体涉及一种基于阳离子交换膜的酶固定化方法及酶微反应器。
技术介绍
“鸟枪”法是一种被广泛使用的蛋白质组学研究策略，通常包括蛋白质酶解、多肽分离及质谱检测三个步骤，其中，高效完全的酶解是保障研究结果准确可靠的重要前提。传统溶液酶解存在的一些不足之处，如酶解时间长、酶的自身降解等，使得它已不可能满足蛋白质组学高效率、高通量的发展要求。酶的固定化技术很好地克服了溶液酶解的这些不足， 酶固定到载体上后，酶的局部浓度增加，提高了酶解效率；同时酶的自身降解减少，酶的稳定性提高，而且固定化酶可以重复利用。近年来发展起来的酶微反应器，将酶固定化技术与微反应器技术相结合，在实现酶固定化的同时，还充分利用了微反应器的诸多优点，如比表面积大、传质速度快、通量高、样品消耗量少等，为蛋白质快速高效酶解提供了理想的技术D ο通常，酶在微反应器中的固定化方法有物理吸附、共价结合、静电结合等，所采用的载体有填充颗粒、整体柱、膜、毛细管或芯片通道的内壁等。其中，整体柱因其柱压低、传质速度快等特点应用最为广泛。然而整体柱通常是自行制备，与之相比，有许多种类已商品化的膜，如聚二氟乙烯多孔膜(PVDF)、等离子聚合膜(PPF)、纤维素膜、尼龙膜等，可以购买直接使用；并且以膜为载体，具有内表面大、局部酶浓度高的优点，因此，以膜作为固定化酶的载体有着良好的应用前景。在各种酶固定化方法中，静电结合用于酶的固定，与物理吸附相比作用力强，可以减少酶的流失。尽管共价结合是相对最为牢固的固定化方法，然而通常需要多步骤的反应， 过程复杂，耗时长，而且可能造成酶活性的损失。相比之下，静电结合，固定化过程简单快速，对酶活性影响较少，因此，静电结合是更为理想的酶固定化方法。
技术实现思路
针对溶液酶解和现有的酶微反应器技术存在的不足，本专利技术提供一种基于阳离子交换膜的快速酶固定化方法。本专利技术的另一个目的是提供一种新型酶微反应器，采用以阳离子交换膜为载体的酶固定化方法，为蛋白质组学研究提供快速高效的蛋白质酶解技术手段。本专利技术酶固定化方法以阳离子交换膜为载体，静电结合用于酶的固定。本专利技术酶微反应器的核心组件-反应腔由第一阳离子交换膜1、聚醚醚酮(PEEK) 薄膜2 (50 200 μ m厚)和第二阳离子交换膜3组成，如附图说明图1所示。PEEK薄膜2上刻蚀有微通道4，微通道4穿透PEEK薄膜2的上下表面。通过机械压力或者粘合剂，PEEK薄膜2 的上表面与第一阳离子交换膜1的下表面紧密贴合，并且PEEK薄膜2的下表面与第二阳离子交换膜3的上表面紧密贴合。PEEK薄膜2和与其紧密贴合的第一和第二阳离子交换膜1和3的膜表面组成的腔体即为酶微反应器的反应腔。第一和第二 PEEK管5和6分别与微通道4的两端相通，作为微通道4的入口和出口管路。微通道4以及第一和第二 PEEK管 5和6都采用PEEK材料来减少酶、被分析蛋白质以及酶解产生的多肽在这些部位的非特异吸附。此外，本专利技术设计的微通道4的流路与膜平行，酶或蛋白质溶液即使以较高流速通过时，系统也可以维持较低压力。本专利技术所述的酶微反应器的操作流程包括以下三步1.酶固定化。胰蛋白酶溶解于pH为7. 5 8. 5的缓冲溶液中，胰蛋白酶溶液连续通过酶微反应器2-10分钟即可完成酶固定化。胰蛋白酶的pi值为10. 5，在pH值7. 5 8. 5的缓冲溶液中带正电荷，通过静电作用与阳离子交换膜相结合，此外，阳离子交换膜的高聚物基质还可以通过疏水作用吸附酶。2.蛋白质酶解。经过变性或其他方式处理过的蛋白质溶液连续通过酶微反应器， 蛋白质在通过微反应腔的数秒内即可完成酶解。流出物收集在样品瓶或者其他接受装置中，然后经液相色谱/质谱(LC/MQ对酶解产物进行分析，通过得到的多肽信息对蛋白质进行分析。3.酶微反应器的再生。在完成一次蛋白质样品酶解后，依次通过含NaOH的NaCl 水溶液、HCl水溶液和纯水对酶微反应器进行再生。再生后的酶微反应器重复1 3操作对另一个蛋白质样品进行分析。本专利技术的积极进步效果在于a.酶通过静电作用和疏水作用固定在阳离子交换膜上，固定化过程对酶活性影响较小，而且只需要数分钟，与已报道的酶固定化技术相比时间大大缩短；b.蛋白质溶液连续通过酶微反应器，在数秒内即可完成酶解，酶解过程简单快速；c.酶微反应器在完成一次蛋白质酶解后快速再生，完全避免了不同蛋白质酶解结果的干扰，提高了蛋白质分析的准确性；d.酶微反应器易于与其他蛋白质样品处理或多肽分离分析技术在线联用，可以为蛋白质分析提供高效、自动化程度高的技术平台。下面通过酶微反应器在酶固定量、酶活性和酶解反应的重复性等方面以及酶微反应器与LC/MS在线联用系统在蛋白质分析中的应用方面的研究证明本专利技术的有益效果和实用性。一.酶微反应器的酶固定量及酶活性的研究胰蛋白酶溶液(lmg/mL，缓冲溶液:50mMTris, 20mM CaCl2,HCl 调节 pH 至 8. 0)以 5 μ L/min的流速连续通过酶微反应器(微通道4尺寸40mm长，240 μ m宽，50 μ m深)2分钟，通过LC/MS测定酶溶液通过酶微反应器前后减少的酶量，计算得出经过2分钟的固定化过程，酶在酶微反应器中的固定量为2. 6 μ g。已知微通道4接触的上下两层阳离子交换膜1和3的膜表面积总和为0. 192cm2，故酶在膜上的吸附量为13. 5μ g/cm2。选用N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)研究了固定化酶的活性，并将其与溶液中酶的活性进行了比较。BAEE及其酶解产物N-苯甲酰-L-精氨酸(BA)由配置有紫外(UV) 检测器的LC分析，实验条件如下色谱柱为C8反相色谱柱(柱长150mm，内径2. Imm,填料粒径5μπι)；流动相为75%乙腈/25%水(含0. 5%三氟乙酸)，流速为0. 2mL/min ；UV波长 % 254nm0实验得到的典型色谱图如图2 (a)所示。五个浓度的BAEE (5、10、20、50、IOOmM, 溶解于50mM NH4HCO3)分别以2 μ L/min的流速通过再生后的酶微反应器(恒温于37°C水浴中，酶解时间14.4秒)，收集流出物由^/而分析8々生成量。用以对照的溶液酶解的酶解时间为10分钟，酶解温度为37°C。图2(b)和(c)分别为微反应器固定化酶和溶液中酶的Lineweave-Burk方程回归直线，计算得到的Km值分别为20. 7和4. 8mM，每μ g酶对应的 Vmax分别为155. 7和1. 5mM/s，可见微反应器酶的Vmax是溶液中酶的100多倍，证明了酶微反应器快速高效的酶解能力。二.酶微反应器的酶解反应重复性的研究本研究先考察了所采用的再生条件的有效性。完成0. lmg/mL细胞色素C(CYC) 酶解的酶微反应器经过再生后，依次以2 μ L/min的流速通过50mM NH4HCO3和0. lmg/mL CYC (溶液通过微反应器时间为14. 4秒)，收集流出物由LC/MS分析，LC实验条件如下色谱柱为C18反相色谱柱(柱长150_，内径2. Imm,填料粒径5 μ m)；流动相A相为水(含0. 1 % 甲酸)，B相为乙腈(含0. 甲酸)，洗脱程序0-15分钟5% B, 15-65分钟5% -60% 本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种酶固定化方法，以膜作为酶固定化的载体，静电结合用于酶固定，其特征在于，所述载体为阳离子交换膜。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘虎威，周志贵，周宇，白玉，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：11
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