本发明专利技术涉及一种具有延长白细胞介素－１８结合蛋白体内半衰期的方法，在白细胞介素－１８结合蛋白易受蛋白酶降解部位引入半胱氨酸，使白细胞介素－１８结合蛋白通过半胱氨酸的巯酯键两两共价结合，阻止了白细胞介素－１８结合蛋白与蛋白酶的结合，提高了白细胞介素－１８结合的活性和延长了其在体内的半衰期。本发明专利技术也提供包括所述蛋白质药物学上可接受的组合物，制备该组合物的方法，和在治疗各种疾病、状况或病症中使用该组合的方法，以提高药物在体内的半衰期和生物活性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种具有延长G细胞介素-18结合蛋白体内半衰期的方法
技术介绍
蛋白质药物在血液、肝脏或肾脏内容易发生变性或酶解。因为蛋白质药物的低稳定性， 为了保持活性物质的有效血浆浓度，所以要求以持续的频率施用对患者施用多肽药物。此外， 因为蛋白质药物通常足通过注射被施用，所以蛋白质药物的频繁注射给患者造成了相当的不 便。因此，己有许多研究在开发具有被提高的血液循环半衰期并同时保持其高药理功效的蛋 白质药物。这些想得到的蛋白质药物也应当满足了对提高的血清稳定性、高活性、对各种蛋 白的可应用性以及当注射到患者体内时诱发非所需的免疫应答的低可能性的要求。用于提高蛋0质稳定性的最常用的方法之一足用高度可溶的大分子，例如聚乙二醇 ("PEG")，对多肽进行化学修饰，该大分子阻止了多肽与蛋白酶的接触。也熟知的是当 PEG被特异地或非特异地连接到多肽药物时，PEG增加了多肽药物的可溶性并防止其被水解， 从而增加了多肽药物的血清稳定性，并且因为它的低抗原性而不引起任何免疫应答。但是， 这些PEG化(pegylated )多肽所具有的缺点是当PEG的分子量增加时降低了活性物质的活 性和产量。在US5， 738， 846和W092/6221中分别公丌了与两个被激活的PEG缀合的千扰素和 被连接到两个具有不同活性的多肽上的PEG间隔物；但是在延长生理学活性多肽的体内活性 方面，它们没有显示出任何突出的效果。也报道了通过经异质双功能(hetero-bifunctional) PEG将重组人粒细胞集落刺激因子 ("G-CSF")共价连接到蛋白上可延长G-CSF的循环半衰期。但是，经修饰的G-CSF-PEG-蛋白的稳定性只比真G-CSF( autheniic G-CSF)高4倍，因此它还不能被投入到实践应用中。作为另一种增强生理学活性多肽的体内稳定性的方法，通过利用重组技术在转化体中生 成了与稳定的蛋白质融合的活性多肽。例如，己知A蛋白是用于增强与其融合的多肽的稳定 性的最有效的蛋白质中的一种，己经报道的这样的融合蛋白有很多(W093/15199和 W093/1520Q,和EP413，622)。但是，与白蛋白结合的融合蛋白仍有活性被降低的问题。US5， 045， 312公丌了 一种为了增强生K激素的活性，使用交联剂，例如碳化二亚胺、戊二 醛、酞基氯等将生长激素缀合到牛血清白蛋白或鼠免疫球蛋白上的方法。但是，这一方法是 单独地针对于增强靶生长激素的活性。另外，使用化学化合物例如碳化二亚胺、戊二醛、酞 基氯等作为交联剂是不利的，这是由于它们强烈的毒性和反应的非特异性。己经报道了免疫球蛋白能用作抗体以呈现出依赖抗体的细胞毒性(ADCC)和依赖补体的 细胞毒性(CDC)的抗休，糖链在ADCC及CDC中发挥了重要作用。尽管缺失糖链，无糖基化 免疫球蛋白具有与糖基化免疫球蛋白相似的血液半衰期，但是由于去糖基化，它对补体或受 体的亲和力下降了 10到1000倍。尽管在将生理学活性多肽与各种大分子进行组合方面己经进行了很多的尝试，但是所有 的尝试都不能达到同时增加稳定性和活性。作为一种用于增强活性蛋白的稳定性并同时保持 其体内活性的改进方法，本专利技术提供了 一种蛋0质彼此共价连接的一种生理学活性蛋白。
技术实现思路
因此，本专利技术的第一个目的是提供-一种具有体内半衰期被延长的生理学活性蛋白的、且 不诱导患者体内的免疫应答、同时将蛋白活性提高的蛋白质药物。本专利技术的另一个目的是提供--4中用于制备包括共价连接的一种生理学活性蛋白的方法。本专利技术的另一个目的是提供一种包括具有延长的体内卡衰期的所述的生理学活性蛋白质 药物组合物。本专利技术的另一个目的是提供一种增强生理学活性蛋白的体内稳定性并延长其循环半衰期 且增强其活性的方法。以下实施的方式进一歩阐述本专利技术。但是，并不能认为本专利技术限制于以下的优选实施。 具体实施方案1. 白细胞介素-18结合蛋白的基因定点突变挑取白细胞介素-18结合蛋白表达菌株单菌落至LB培养基中培养过夜，第二夭上午转接 至SPI培养基中，培养至对数生长末期；取培养液至SP工I培养基中培养，取适量加入EP管中， 离心收集菌体，弃静培养基加入预冷的MgC1.2 ，轻轻摇动悬浮菌体，冰上静置，离心收集菌 体，弃静MgCL溶液，每管加入预冷的CaCl2 ，轻轻摇动悬浮菌体，冰上静置，离心收集菌 体，弃静CaCL溶液，每管加入适量的CaCh，加入DNA,轻轻混匀，静止。用SPII培养基稀释， 涂平板培养基。通过定点突变引入半胱氨酸。2. 白细胞介素-18结合蛋白的纯化及其相互组合高速离心机收集菌并加氢氧化钠裂解菌，加入缓冲液洗涤并超声破碎，挂镍柱除去杂蛋 G，洗脱蛋白并离子交换获得纯蛋白加入少量硫酸，待反应完全收集备用。3. 白细胞介素-18结合蛋白组合物半衰期检测根据使用动物模型的体内试验，本专利技术的白细胞介素-18结合蛋白组合物在体内的半衰 期延长了 10倍，很好的解决/ 0细胞介素-18结合蛋O在体内半衰期过短并需频繁给药的问 题。另外，根据使用动物模型的体内试验，白细胞介素-18结合蛋白组合物表现出极好的体 内活性。权利要求1.，其特征在于，在白细胞介素-18结合蛋白易受降解部位引入半胱氨酸，使白细胞介素-18结合蛋白通过引入的半胱氨酸的共价键两两结合，形成白细胞介素-18结合蛋白组合物。2 .如权利要求l所述方法，其特征在于，所述半胱氨酸，包括所有的氨基酸。3 .如权利要求1所述方法，其特征在于， 结合蛋白相互组合。4 .如权利要求1所述方法，其特征在于， 肽键等连接。5.如权利要求l所述方法，其特征在于， 干扰素及其受体。所述两两结合包括两个及以上的白细胞介素-18 所述共价键连接包括通过巯酯键、酯键、醚键、 所述白细胞介素-18结合蛋白包括各种细胞因子、6.如权利要求3的白细胞介素-18结合蛋白相互组合，可以是非同种蛋白之间组合。全文摘要本专利技术涉及一种具有延长白细胞介素-18结合蛋白体内半衰期的方法，在白细胞介素-18结合蛋白易受蛋白酶降解部位引入半胱氨酸，使白细胞介素-18结合蛋白通过半胱氨酸的巯酯键两两共价结合，阻止了白细胞介素-18结合蛋白与蛋白酶的结合，提高了白细胞介素-18结合的活性和延长了其在体内的半衰期。本专利技术也提供包括所述蛋白质药物学上可接受的组合物，制备该组合物的方法，和在治疗各种疾病、状况或病症中使用该组合的方法，以提高药物在体内的半衰期和生物活性。文档编号C07K1/107GK101274954SQ200810023490公开日2008年10月1日 申请日期2008年4月16日 优先权日2008年4月16日专利技术者海 庞, 鹏 王, 陈晓翔 申请人:江苏大元生物科技有限责任公司本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种延长白细胞介素－１８结合蛋白体内半衰期的方法，其特征在于，在白细胞介素－１８结合蛋白易受降解部位引入半胱氨酸，使白细胞介素－１８结合蛋白通过引入的半胱氨酸的共价键两两结合，形成白细胞介素－１８结合蛋白组合物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：庞海，陈晓翔，王鹏，
申请(专利权)人：江苏大元生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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