在哺乳动物细胞中产生具有延长的循环半衰期的重组糖蛋白的方法技术

本发明专利技术提供了用于产生重组糖蛋白的方法和重组表达系统，所述重组糖蛋白具有增加的唾液酸含量且主要含有α2-6唾液酸键联。本发明专利技术还提供了具有延长的体内循环半衰期的重组糖蛋白。本文所述的糖蛋白的一种潜在应用是用于治疗和预防由神经毒素引起的中毒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在晡乳动物细胞中产生具有延长的循环半衰期的重组糖蛋白的方法专利技术背景专利
本专利技术总体上涉及重组表达系统并且更具体地说涉及用于生物合成具有增加的α 2-6唾液酸含量的糖蛋白的方法。背景信息有机磷(OP)试剂抑制神经细胞中的乙酰胆碱酯酶(AChE)的能力使得其能够用作杀虫剂、除草剂以及强有力的神经毒剂，包括Sarin、Tabun, Soman以及VX。它们对胆碱能神经系统的神经毒性效应如果没有得到适当地治疗则可能导致气哽感、视力丧失、唾液分泌过多、胃痉挛、呕吐、腹泻、肌肉痉挛、失去意识以及死亡。反应的原因是分解乙酰胆碱的能力的丧失，从而导致神经细胞的过度刺激。因为暴露于OP代表未来的潜在的化学危险，所以可用于预防这些化学品的试剂代表保护作战人员和平民免于化学中毒的一个重大机遇。保护士兵以对抗OP试剂的一种手段是通过注射生物清除剂，所述生物清除剂结合至这些OP试剂并且防止它们到达作用部位。OP神经毒剂如sarin、soman以及VX代表我们的作战人员和平民人群所面临的最危险的化学武器威胁中的一些，因为这些致死剂可以由境外实体或恐怖组织生产。作为结果，这些试剂可以为与美国利益相悖的组织所拥有。此外，如果这些试剂进行大面积地传播，那么所述试剂有可能使数以千计的作战人员或平民致残、伤害或甚至杀死他们。因此，预防它们的毒性的医疗措施将非常有助于预防或减轻由这些OP神经毒剂所表现的毒性效应。OP-清除剂当用作保护性预防剂时，在目前代表了用于预防由于在化学危险区中暴露于这些神经毒素而对作战人员和平民所造成的伤害或使这种伤害减至最小的最佳替代品中的一种。OP-清除剂的最可能的终端用户是在战争区的美国和盟军作战人员，在所述战争区中存在暴露于此类化学神经毒剂的重大机会或危险。第二种终端用户将是在美国保护下的平民，这些平民处在恐怖分子或流氓政权的化学攻击的重大风险之中。最有名的生物清除剂候选物之一是丁酰胆碱酯酶(BChE)，包括人血浆丁酰胆碱酯酶(huBChE)。BChE是在人和其它动物中发现的胆碱酯酶家族的天然血浆酶。BChE是具有约340kDa的分子量和在体内的持续半衰期的四聚体丝氨酸酯酶。尽管huBChE的确切生理机能尚未知晓，但这种酶可以预防暴露于OP化合物的动物中毒。在作为生物清除剂的作用中，huBChE直接结合至神经毒剂，从而将其螯合以避免作用于神经毒剂的乙酰胆碱酯酶主要目标。关于OP化合物的其它酶清除剂，huBChE具有广谱活性和(如果有的话)有限的生理副作用。此外，源自血浆的人BChE(huBChE)在体内具有处于数十小时范围内的持续且较长的平均驻留时间。因此，施用外源huBChE代表一种用于预防OP试剂对于所暴露个体的毒性的潜在宝贵策略。然而， 这种生物清除剂不能降解神经毒剂且作为结果，所述蛋白质清除剂要有效则需要近似mg/kg体重的剂量。huBChE可以从人血浆获得，然而，这种手段不是最佳的，因为很难获得在可能的军事紧急状态下所需的较大量，特别是从血浆对于其它未得到满足的医疗需求的重要性来看。因为huBChE在蛋白质与OP试剂的1:1化学计量下对保护是有效的，所以要求足以适用于军事的量的这种酶的替代来源。因此，生产大量有效的huBChE呈现为军事上进行成功预防以抵抗作战人员对于OP神经毒素的暴露的一个主要障碍。已经对用于大规模生产rhuBChE的重组表达系统进行了探究，且作为结果，所述蛋白质已经在包括大肠杆菌、哺乳动物以及转基因动物的表达系统中表达。考虑到CHO源性产物在生物技术产业中的成功，推断来自CHO且或许是其它哺乳动物细胞的rhuBChE也将有效作为人血浆源性BChE的替代品。不幸的是在所有情况下，重组人BChE (rhuBChE)尚未同血浆源性huBChE —样有效，主要是因为循环半衰期可能缩短了许多倍，从而产生了不能在战地长期发挥作用的试剂。当前的rhuBChE无效的原因归咎于用于产生这种蛋白质的表达系统，所述表达系统不具有产生特性与天然huBChE类似的产物所必需的合成能力。由于作战人员可能有长期的潜在暴露，所以希望开发一种在体内具有延长的循环半衰期的BChE生物清除剂。近来，研究人员试图通过附着聚乙二醇(PEG)分子以增加蛋白质的大小且或许降低其免疫原性来解决重组人形式的BChE (rhuBChE)的有限半衰期的问题。然而，这一修饰同样具有限制。在一项研究中，重组人BChE展现比小鼠中的天然血清源性HuBChE的平均驻留时间短2.5倍的平均驻留时间。为了提高半衰期，研究人员通过添加PEG分子来对重组HuBChE(rHuBChE)进行化学修饰。添加PEG确实将平均驻留时间延长至36.2小时；然而，这仍然小于血浆源性形式的值。在另一项研究中，用天然和重组猕猴BChE (MaBChE)来进行聚乙二醇化作用并且由曲线下面积(AUC)所表示的药物代谢动力学概况也得到改良但仍然小于天然MaBChE。此外，重复注射PEG-rhuBChE在小鼠中产生比未结合的酶高若干倍的抗-rhuBChE抗体。尽管在一些情况下，降低的免疫原性已经在酶、细胞因子以及激素的聚乙二醇化作用之后观察到，但是聚乙二醇化的干扰素-β-1a在猴子中的施用事实上产生提高的免疫原性。当前技术水平将BChE的可获得性专属地限制于人血浆天然来源。这大幅度地减少了可以被给予可获得的保护和剂量的作战人员和平民的潜在数量，因为当前仅存在有限的血浆供应。在化学试剂可能被用作遍布人口众多地区的武器时，这尤其成问题。此外，当前的rhuBChE供应就循环驻留时间来说是不令人满意的，因为所用表达系统不能生成与天然的血浆源性产物具有相同的特性和生物有效性的产物。专利技术概述本专利技术是基于以下开创性发现:糖蛋白的体内循环半衰期是通过唾液酸含量和糖类键联的性质来调节的。糖蛋白如丁酰胆碱酯酶(BChE)上的唾液酸附着对于延长的循环半衰期来说很关键。α 2-3唾液酸键联可能比α 2-6唾液酸键联更容易受到酶促降解。影响糖蛋白的四级结构的翻译后加工事件也促成药物代谢动力学概况并且糖蛋白装配成为多聚体增加它们的体内驻留时间。本专利技术提供一种分离的哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，所述细胞包括异源的(heterologous) α 2_6唾液酸基转移酶(ST6GAL1)核酸序列。一方面,所述细胞含有编码人丁酰胆碱酯酶(huBChE) 的核酸序列。另一方面，所述细胞包括减少α 2-3唾液酸基转移酶基因(St3gall)的表达或使这种基因沉默的核酸序列。例如，使St3gall基因沉默的核酸序列可以是RNA干扰(RNAi)途径中涉及到的小干扰RNA(SiRNA)、短干扰RNA、或沉默RNA。使St3galI基因沉默的核酸序列还可以是微小RNA(miRNA)分子。或者，St3gall基因可以例如由锌指核酸酶进行敲除。在一个实施方案中，编码ST6GAL1和huBChE的核酸序列、以及减少St3gall的表达或使其沉默的核酸序列全部同时共表达。另一方面，所述细胞进一步包括编码减少或抑制α 2-6唾液酸降解的酶的核酸序列。分离的哺乳动物细胞可以进一步包括编码ColQ基因的富含脯氨酸的附着结构域(PRAD)的核酸序列，所述核酸序列可以与编码ST6GAL1和huBChE的核酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.01.06 US 61/430,2561.一种分离的哺乳动物细胞，其包含异源α 2-6唾液酸基转移酶(ST6GAL1)核酸序列。2.如权利要求1所述的细胞，其中所述细胞是CHO细胞。3.如权利要求1所述的细胞，其进一步包含编码人丁酰胆碱酯酶(huBChE)的核酸序列。4.如权利要求1所述的细胞，其进一步包含减少α2-3唾液酸基转移酶基因(St3gall)的表达或使所述基因沉默的核酸序列。5.如权利要求4所述的细胞，其中使St3gall沉默的所述核酸序列选自由SiRNA和miRNA组成的组。6.如权利要求1所述的细胞，其进一步包含用于敲除St3gall基因的装置。7.如权利要求1所述的细胞，其中所述细胞进一步包含编码ColQ基因的富含脯氨酸的附着结构域(PRAD)的核酸序列。8.—种重组糖蛋白，其包含α 2-6唾液酸键联。9.如权利要求8所述的糖蛋白，其中所述糖蛋白呈四聚体装配状态。10.如权利要求8所述的糖蛋白，其中所述糖蛋白是重组huBChE(rhuBChE)。11.如权利要求8所述的糖蛋白，其中所述糖蛋白具有延长的循环半衰期或平均驻留时间(MRT)。12.如权利要求1所述的细胞，其进一步包含编码减少或抑制α2-6唾液酸降解的酶的核酸序列。13.一种用于生物合成富含α 2-6的糖蛋白的方法，所述方法包括在共表达编码肽的核酸序列的条件下培养如权利要求1所述的细胞。14.如权利要求13所述的方法，其进一步包括抑制α2-3唾液酸基转移酶的表达。15.如权利要求13所述的方法，其进一步包括减少或抑制α2-6唾液酸的降解。16.如权利要求15所述的方法，其中通过提高防止α2-6唾液酸降解的酶的活性来减少或抑制α 2-6唾液酸降解。17.如权利要求16所述的方法，其中所述酶是岩藻糖基转移酶。18.如权利要求17所述的方法，其中所述岩藻糖基转移酶是α3岩藻糖基转移酶(a 3Fuc...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·J·比特邦，
申请(专利权)人：约翰·霍普金斯大学，
类型：
国别省市：