卵巢和子宫内膜癌的帕帕尼科拉乌测试制造技术

本申请涉及卵巢和子宫内膜癌的帕帕尼科拉乌测试。最近开发的基于液体的帕帕尼科拉乌(Pap)涂片不仅允许进行细胞学评估，而且允许采集用于检测宫颈癌病原体HPV的DNA。本发明专利技术测试了这些样本，以检测存在于稀少的肿瘤细胞中的体细胞突变，该肿瘤细胞一旦从子宫内膜癌和卵巢癌中排出，可在宫颈中积累。收集子宫内膜癌和卵巢癌中一组常见突变的基因并用于鉴定所有46个子宫内膜或宫颈癌组织样本中的突变。本发明专利技术还能够鉴定来自100％的子宫内膜癌(24个中的24个)和41％的卵巢癌(22个中的9个)中的液体巴氏涂片的DNA中相同的突变。本发明专利技术开发了基于序列的方法，以在没有肿瘤基因型现有知识的情况下查询单个液体巴氏涂片中12种基因中的突变。

Papanicolaou test for ovarian and endometrial cancer

This application involves the Papanicolaou test for ovarian and endometrial cancer. The recently developed liquid-based Papanicolaou (Pap) smear allows not only cytological assessment but also DNA collection for detection of HPV, a pathogen of cervical cancer. The present invention tests these samples to detect somatic cell mutations existing in rare cancer cells, which can accumulate in the cervix once discharged from endometrial and ovarian cancers. A group of common mutations in endometrial and ovarian cancers were collected and used to identify mutations in all 46 samples of endometrial or cervical cancer tissues. The present invention can also identify the same mutations in DNA from liquid Papanicolaou smears of 100% endometrial cancer (24 out of 24) and 41% ovarian cancer (9 out of 22). The invention develops a sequence-based method to query mutations in 12 genes in a single liquid Papanicolaou smear without prior knowledge of the tumor genotype.

【技术实现步骤摘要】
卵巢和子宫内膜癌的帕帕尼科拉乌测试本申请是分案申请，原申请的申请日为2013年10月17日、申请号为201380068411.8、专利技术名称为“卵巢和子宫内膜癌的帕帕尼科拉乌测试”。本专利技术利用美国国家癌症研究所和美国国立卫生研究院的基金进行。美国政府保留根据NCI协议N01-CN-43309和NIH资助CA129825和CA43460的条款的特定权利。
本专利技术涉及癌症筛查领域。具体地，其涉及卵巢癌和子宫内膜癌。
技术介绍
由于帕帕尼科拉乌测试(帕氏测试)的推行，在经筛查的人群中宫颈癌的发生率和死亡率已经降低了超过75％(1、2)。相反，在同一分期内由于卵巢癌和子宫内膜癌的死亡数并没有显著降低。结果，2012年在美国超过69,000名女性被诊断出卵巢癌和子宫内膜癌。虽然子宫内膜癌比卵巢癌更常见，但后者更为致命。在美国，预计每年有大约15,000和8,000名女性分别死于卵巢癌和子宫内膜癌(表1)。在世界范围内，仅今年就预计有超过200,000例由于这些肿瘤而死亡(3、4)。为了复制宫颈癌筛查的成功，已经设计出几种早期检测子宫内膜和卵巢癌的方法。对于子宫内膜癌，工作已经集中于细胞学和经阴道超声(TVS)。在一些情况下，细胞学确实能够指示子宫内的赘生物，虽然具有低特异性(5)。TVS是基于包含癌症的子宫内膜比正常的子宫内膜厚的事实、测量子宫内膜厚度的无创技术(6)。和细胞学一样，由于良性病变如息肉也可导致子宫内膜变厚，因此利用TVS筛查测量子宫内膜厚度缺乏足够的特异性。因此，细胞学和TVS均没有满足筛查测试的要求(5,7)。已经做出更大的努力来利用血清CA-125水平和TVS开发卵巢癌的筛查测试。CA-125是在具有早期疾病的卵巢癌患者亚组中增加的体腔和苗勒源上皮所表达的高分子量跨膜糖蛋白(8)。由于其也在多种良性状况，如盆腔炎、子宫内膜异位和卵巢囊肿中增加的事实，CA-125的特异性受到限制(9)。TVS可显现卵巢，但仅仅可检测大的肿瘤，且不能确定地区分良性肿瘤和恶性肿瘤。已经进行了几种利用血清CA-125和TVS的临床筛查测试，但均没有显示生存效益。实际上，与对照相比，一些已经显示发病率的上升，因为假阳性测试引出通过腹腔镜检查或剖腹探查术的进一步评估(10-12)。因此，美国预防服务工作组、美国癌症学会、美国妇产科医师协会以及美国国家综合癌症网络，不建议在普通人群中常规筛查子宫内膜癌和卵巢癌。实际上，这些组织提醒“潜在危害大于潜在益处”(13-16)。已经对具有卵巢癌遗传素质的患者，例如BRCA基因种系突变的患者或具有Lynch综合征的患者进行这种建议的例外。建议在相对较早的年龄开始每6个月用TVS和血清CA-125筛查BRCA突变携带者。患有Lynch综合征的女性的筛查方针包括在30和35岁之间开始的每年子宫内膜取样和TVS(15、17)。与未检测到的妇科恶性肿瘤有关的死亡率已经使得有效筛查工具的开发被优先考虑。启发目前的研究的重要观察发现是无症状的女性偶尔呈现在作为其常规宫颈癌筛查程序一部分的细胞学样本中检测到异常腺细胞(AGCs)。虽然在一些情况下AGCs与恶变前疾病或恶性疾病有关(18-22)，但通常难以将由宫颈内癌、子宫内膜癌和卵巢癌产生的AGCs相互区分或与更良性的状况区分。本领域依然需要在比目前所进行的更早的阶段检测这些癌症。
技术实现思路
根据本专利技术的一个方面，提供检测或监测子宫内膜癌和卵巢癌的方法。针对在子宫内膜癌和卵巢癌中突变的一种或多种基因、mRNAs或蛋白质的遗传或外遗传改变，测试患者的液体巴氏涂片。改变的检测指示在患者体内存在这种癌症。根据本专利技术的另一方面，提供筛查子宫内膜和卵巢癌的方法。针对选自以下的基因、mRNA或蛋白质的一种或多种突变，测试液体巴氏涂片：CTNNB1、EGFR、PI3KCA、PTEN、TP53、BRAF、KRAS、AKT1、NRAS、PPP2R1A、APC、FBXW7、ARID1A、CDKN2A、MLL2、RFF43和FGFR2。突变的检测指示患者体内存在这种癌症。本专利技术的另一方面是测试卵巢或子宫内膜癌的巴氏涂片样本中的一组基因的试剂盒。试剂盒包括至少10种探针或至少10种引物对。每种探针或引物包括至少15nt的与一组基因中的一种互补的序列。至少10个不同的基因受到检查。所述组选自CTNNB1、EGFR、PI3KCA、PTEN、TP53、BRAF、KRAS、AKT1、NRAS、PPP2R1A、APC、FBXW7、ARID1A、CDKN2A、MLL2、RFF43和FGFR2。本专利技术的另一方面是包含至少10种连接的探针的固相支持体。每种探针包括至少15nt的与一组基因中的一种互补的序列，其中该组选自CTNNB1、EGFR、PI3KCA、PTEN、TP53、BRAF、KRAS、AKT1、NRAS、PPP2R1A、APC、FBXW7、ARID1A、CDKN2A、MLL2、RFF43和FGFR2。本专利技术的另一方面是包含至少10种与其连接的引物的固相支持体。每种引物包括至少15nt的与一组基因中的一种互补的序列。该组选自CTNNB1、EGFR、PI3KCA、PTEN、TP53、BRAF、KRAS、AKT1、NRAS、PPP2R1A、APC、FBXW7、ARID1A、CDKN2A、MLL2、RFF43和FGFR2。在阅读说明书之后对本领域技术人员显而易见的这些和其它实施方式向本领域提供在筛查环境中利用已经常规采集的样本测定卵巢和子宫内膜癌的方法。附图说明图1.示意图显示本研究中所述程序的原理步骤。从卵巢癌或子宫内膜癌中排出的肿瘤细胞被带入子宫颈内管。这些细胞可被用于进行常规巴氏涂片的刷捕获。刷的内含物被转移至液态固定剂中，从中分离DNA。利用下一代测序，针对指示女性生殖道中恶性肿瘤的存在的突变查询该DNA。图2.用于同时检测12种不同基因中的突变的测定的图。显示Safe-SeqS(安全-测序系统)实验方案的改进，用于同时询问单个样品中的多个突变。在标准Safe-SeqS程序中，只评价一种扩增子，而新系统用于同时评价来自多个基因的多种扩增子。图3.巴氏涂片流体中的突变体等位基因分数。显示来自46种巴氏涂片流体的每一种的突变体等位基因的分数。每个肿瘤的分期列于Y-轴上。X-轴显示由Safe-SeqS测定的％突变体等位基因分数。图4.热图显示巴氏涂片流体中12种基因的多重测试结果。y-轴上的每个方块代表来自所示基因的30-bp的序列区组。评价的28个样本(14个来自患有癌症的女性，14个来自不患有癌症的正常女性)表示于x-轴上。突变表示为彩色的方块，白色表示没有突变，黄色表示0.1％至1％的突变体分数，橙色表示1％至10％的突变体分数，红色表示>10％的突变体分数。图5.表1.卵巢和子宫内膜肿瘤的流行病学。列出来自卵巢癌和子宫内膜癌主要亚型的美国新病例和死亡的估计数量。图6.表2.卵巢癌和子宫内膜癌的遗传特征。列出卵巢癌和子宫内膜癌中常见突变的基因的频率。图7.表S1.通过全外显子组测序研究的子宫内膜癌(子宫内膜样亚型)。列出用于外显子组测序的22例癌症的概括特征。图8.表S3.在巴氏涂片中评价的突变。列出46个肿瘤样本的临床特征，以及每个病例中鉴定的突变和在巴本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.方法，包括：针对在子宫内膜癌或卵巢癌中突变的一种或多种基因、mRNA或蛋白质的遗传或外遗传改变，测试患者的液体巴氏涂片。

【技术特征摘要】
2012.10.29 US 61/719,9421.方法，包括：针对在子宫内膜癌或卵巢癌中突变的一种或多种基因、mRNA或蛋白质的遗传或外遗传改变，测试患者的液体巴氏涂片。2.权利要求1所述的方法，其中所述改变是置换突变。3.权利要求1所述的方法，其中所述改变是重排。4.权利要求1所述的方法，其中所述改变是缺失。5.权利要求1所述的方法，其中所述改变是甲基化的丧失或获得。6.权利要求1所述的方法，其中针对所述液体巴氏涂片中存在的所述基因、mRNA或蛋白质的大部分确定所述改变。...

【专利技术属性】
技术研发人员：I·金德，K·W·肯斯勒，B·沃格尔斯坦，N·帕帕佐普洛斯，L·迪亚斯，C·贝蒂加高达，Y·王，
申请(专利权)人：约翰·霍普金斯大学，
类型：发明
国别省市：美国,US