一种用于检测C-kit突变基因的试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种用于检测C‑kit突变基因的试剂盒，包括C‑kit基因扩增检测试剂组，所述C‑kit基因扩增检测试剂组包括用于扩增C‑kit基因的引物组和检测突变型C‑kit基因的探针。本发明专利技术的试剂盒设计了适用于基于微滴式数字PCR系统的引物和探针，以及相应的对照，使其能够用于基于微滴式数字PCR系统的检测系统。检测流程的自动化程度高，效果好，操作非常简便易上手，适宜临床应用及推广。

A Kit for Detecting C-kit Mutant Gene

The present invention relates to a kit for detecting C KIT mutation gene, including a C KIT gene amplification detection kit group, which includes a primer group for amplifying C KIT gene and a probe for detecting mutant C kit gene. The kit of the invention designs primers and probes suitable for the micro-drop digital PCR system and corresponding controls, so that it can be used for the detection system based on the micro-drop digital PCR system. The detection process is highly automated, effective, easy to operate, and suitable for clinical application and promotion.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测C-kit突变基因的试剂盒
本专利技术涉及C-kit基因突变的检测领域，更特别地，涉及一种用于检测C-kit突变基因的试剂盒。
技术介绍
C-kit基因位于人染色体4q12-13，属于原癌基因，其产物是Ⅲ型酪氨酸激酶。C-kit是酪氨酸激酶受体蛋白家族的重要成员之一,作为干细胞因子的受体,可以通过一系列信号通路参与造血干细胞增殖分化的调控。近年来研究发现,C-kit基因存在突变,特别是激活性突变与急性白血病中的发病、治疗和预后等密切相关。胃肠道间质瘤(GIST)是消化道最常见的间叶源性肿瘤。绝大部分的GIST均表达C-kit基因编码的Kit蛋白(CD117)。GIST中C-kit基因突变率约为90％，且突变形式多样。临床研究表明GIST中C-kit基因的突变情况与格列卫分子靶向治疗的疗效相关：存在11号外显子突变患者的疗效最好，存在9号外显子突变的患者疗效次之，而野生型GIST的疗效最差。另外，对于9号外显子突变的患者，提高用药剂量可显著提高疗效。检测C-kit基因突变对于指导GIST患者的合理用药，具有重要的参考价值。近年来还发现，KIT作为一种重要的原癌基因，其突变和或拷贝数变异增加也见于39％的黏膜黑色素瘤和36％的肢端雀斑样黑色素瘤，已有报道将格列卫用于治疗KIT突变的黑色素瘤，并取得了比较满意的疗效。目前，在精准医学的大背景下,液体活检作为一种便捷、微创、能够动态反映肿瘤基因谱全貌的方法在癌症临床研究与实践中发挥着越来越重要的作用。临床上检测C-kit基因突变的常用方法中的测序法和荧光定量PCR法，因为需要采用侵入性样本(肿瘤组织)才能达到其灵敏度，从而不能满足“液体活检”在精准医疗中的至关重要作用。因此，需要一种能够满足临床上最新的诊疗需求，并且操作简便、结果准确、成本低廉和高通量的新型C-kit基因突变检测试剂盒。
技术实现思路
为解决以上问题，本专利技术提供了一种用于检测C-kit突变基因的试剂盒，包括C-kit基因扩增检测试剂组，所述C-kit基因扩增检测试剂组包括用于扩增C-kit基因的引物组和检测突变型C-kit基因的探针。在一个优选实施方案中，用于扩增C-kit基因的引物组的序列如SEQIDNO:1和2所示，检测突变型C-kit基因的探针的序列如SEQIDNO:3所示。在一个优选实施方案中，检测突变型C-kit基因的探针的5’端带有FAM荧光基团，3’端带有BHQ1淬灭基团，并且第3、6、7、8、10和11位核苷酸经LNA修饰。在一个优选实施方案中，所述C-kit基因扩增检测试剂组还包括检测野生型C-kit基因的探针。在一个优选实施方案中，所述检测野生型C-kit基因的探针的序列如SEQIDNO:4所示，所述检测野生型C-kit基因的探针的5’端带有VIC荧光基团，3’端带有BHQ1淬灭基团，并且第3、6、7、8、10和11位核苷酸经LNA修饰。在一个优选实施方案中，所述C-kit基因扩增检测试剂组制成用于检测C-kit基因突变的引物探针预混合液，所述检测C-kit基因突变的引物探针预混合液中每条引物的浓度为500nM-1000nM，探针的浓度为200nM-400nM。在一个优选实施方案中，所述试剂盒还包括阳性对照和/或阴性对照，所述阳性对照为含有不低于500拷贝/uL的突变型C-kit基因的溶液，所述阴性对照为突变型C-kit基因低于10拷贝/uL的溶液。在一个优选实施方案中，所述阳性对照和阴性对照中均含有不低于1000拷贝/uL的野生型C-kit基因在一个优选实施方案中，所述试剂盒还包括反转录酶和DTT。在一个优选实施方案中，所述试剂盒还包括用于PCR反应的试剂。市售的试剂盒无法对样本进行准确定量，灵敏度较低。本专利技术的试剂盒设计了适用于基于微滴式数字PCR系统的引物和探针，以及相应的对照，使其能够用于基于微滴式数字PCR系统的检测系统。在检测过程中，将每一个样本的20uL反应液乳化分成20000个独立的微滴，对浓度较低的样本来说，每个微滴中包含的突变型C-kit基因或野生型C-kit基因拷贝数为1或0，通过专用软件自动检测每个微滴的荧光信号，再计数总的阳性微滴数，就能得到准确结果，浓度较高的样本只需进行一定比例的稀释，也能得到准确的结果。检测流程的自动化程度高，效果好，操作非常简便易上手，适宜临床应用及推广。在微小残留检测方面，qPCR较为困难，对于比例较低的融合基因样本来说，市售试剂盒的漏检概率较大，而本专利技术的试剂盒本专利技术中在设计引物和探针时，对探针采用了LNA修饰，很大程度上提高数字PCR检测的稳定性和灵敏，漏检率少，可以直接发布结果，最大程度的提高了发布报告的时间，为临床医生提供快速、准确的辅助用药指导。附图说明图1为阳性对照品检测结果图；图2为阴性对照品检测结果图；图3为1例C-kit基因突变患者检测结果图。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。1.引物和探针设计用于扩增C-kit的引物以及相应的检测探针如下：F1(SEQIDNO：1)：5′-acaaagatttgtgattttggtc-3′；R1(SEQIDNO：2)：5′-cgtttcctttaaccacataatt-3′；检测C-kit突变型的探针：PC-kit-Mut(SEQIDNO：3)：5′-ccagagacatca-3′；其中，C-kit突变型探针PC-kit-Mut(SEQIDNO：3)序列的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ1淬灭基团，此外，探针序列中3,6,7,8,10,11位核苷酸为LNA修饰。检测C-kit野生型基因的探针：PC-kit-WT(SEQIDNO：4)：5′-ccagagacatca-3′；其中，C-kit野生型基因探针PC-kit-WT(SEQIDNO：4)序列的5’端标记VIC荧光基团，3’端标记BHQ1淬灭基团，此外，探针序列中3,6,7,8,10,11位核苷酸为LNA修饰。2.体系反应液的配制1)PCR反应液：包含相应浓度的DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、dATP、dCTP、dTTP和dGTP等；ReverseTranscriltase；DTT。2)引物探针预混合液：将引物及探针各自用双蒸水溶解，每条引物的浓度为100μM，每条探针的浓度为10μM；将F1、F2和PC-kit-Mut的母液以4.5:4.5:25的比例混合；将F1、F2和PC-kit-WT的母液以4.5:4.5:25的比例混合；最终形成引物/探针在反应体系中的浓度为900nM/250nM。3)阳性对照模板：经测序确认的包含突变型质粒与正常基因组DNA(gDNA)的溶液。4)阴性对照模板：经测序确认的包含正常gDNA的溶液。3.检测方法仪器：EppendorfMastercyclerproS定性PCR仪，Bio-radQX200微滴式数字PCR系统(包括微滴生成仪、封膜仪、微滴读取仪)，BECKMAN22R台式微量冷冻离心机，WH-866型涡旋振荡器，低速板式离心机。采集血液样本，用QIAGEN公司QIAampCirculatingNucleicAcidKit(货号55114)，按照试剂盒说明书操作，从血液样本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测C‑kit突变基因的试剂盒，其特征在于，包括C‑kit基因扩增检测试剂组，所述C‑kit基因扩增检测试剂组包括用于扩增C‑kit基因的引物组和检测突变型C‑kit基因的探针。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测C-kit突变基因的试剂盒，其特征在于，包括C-kit基因扩增检测试剂组，所述C-kit基因扩增检测试剂组包括用于扩增C-kit基因的引物组和检测突变型C-kit基因的探针。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，用于扩增C-kit基因的引物组的序列如SEQIDNO:1和2所示，检测突变型C-kit基因的探针的序列如SEQIDNO:3所示。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，检测突变型C-kit基因的探针的5’端带有FAM荧光基团，3’端带有BHQ1淬灭基团，并且第3、6、7、8、10和11位核苷酸经LNA修饰。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述C-kit基因扩增检测试剂组还包括检测野生型C-kit基因的探针。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述检测野生型C-kit基因的探针的序列如SEQIDNO:4所示，所述检测野生型C-kit基因的探针的5’端带有VIC荧光基...

【专利技术属性】
技术研发人员：任绪义，虞闰六，宣文静，胡宏波，曾丹丹，徐子博，
申请(专利权)人：武汉迪安医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42