一种基于数字PCR平台JAK2V617F基因突变的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于数字PCR平台JAK2V617F基因突变的检测方法。这一方法是基于ABI QuantStudio™3D数字PCR系统对JAK2基因的V617F位点进行突变检测，利用MGB探针特异性的区分野生型和突变型的样本，能够同时在低丰度和低灵敏度的样本中得到很好的检测结果，实验可重复性能好，误差小，是检测低丰度地突变比例的优势技术。

A Detection Method of JAK2V617F Gene Mutation Based on Digital PCR Platform

The invention discloses a detection method of gene mutation based on digital PCR platform JAK2V617F. This method is based on ABI QuantStudio 3D digital PCR system to detect V617F mutation of JAK2 gene. Using MGB probe to distinguish wild and mutant samples, it can get good results in low abundance and low sensitivity samples at the same time. The experiment has good repeatability and small error. It is an advantageous technology to detect low abundance mutation ratio.

【技术实现步骤摘要】
一种基于数字PCR平台JAK2V617F基因突变的检测方法
本专利技术涉及生物检测方法
，具体涉及一种基于数字PCR平台JAK2V617F基因突变的检测方法。
技术介绍
自从PCR技术在20世纪80年代被专利技术以来，这一方法已经成为生命科学研究领域中最基础和最常规的实验方法之一。第一代传统的PCR技术采用琼脂糖凝胶电泳的方法来对PCR产物进行分析，但这一方法主要适用于定性和半定量研究。在2()世纪9()年代初出现了第二代的定量PCR(quantitativePCR，qPCR)技术，通过在反应方法中加入荧光染料，检测反应中发出的荧光信号达到阈值的循环数即循环阈值(cyclethreshold，Ct)来计算目的酸序列的含量。qPCR技术因其快速、简易和经济的特点，目前仍被各实验室广泛地使用。但qPCR技术所谓的“定量”仍然是相对的，依赖于Ct值和标准曲线。qPCR在目的序列含量低、表达量差异十分微小、反应方法中含大量背景序列或抑制物等情况下，灵敏度和精确度都受到很大限制。在这种背景下，第三代PCR——数字PCR(digitalPCR，dPCR)应运而生了。数字PCR的原理为dPCR把反应方法均匀分配到大量反应单元中，每个反应单元中不包含或包含一个到多个目的核酸序列，目的核酸序列的数量符合泊松分布。然后在每个反应单元中独立地进行PCR扩增。扩增结束后，检测每个反应单元的荧光信号，最终根据泊松分布和荧光信号阳性的反应单元占所有反应单元的比例来计算目的核酸序列的拷贝数。在dPCR反应中荧光信号的产生过程基本与qPCR相同。dPCR技术qPCR技术有着以下的优势：(1)高灵敏度。dPCR本质上将一个传统的PCR反应变成了数万个PCR反应，在这数万个反应单元中分别独立检测目的序列，从而大大提高了检测的灵敏度。(2)高精确度。dPCR通过计算在数万个反应单元中阳性反应单元数量和比例，可以精确地检测出变化很小的目的序列差异。(3)高耐受性。dPCR技术第一步反应方法分配的过程，可以使背景序列和PCR反应抑制物被均匀分配到每个反应单元，而大部分反应单元中并不含有目的序列，低丰度的目的序列被相对富集于某些反应单元中，从而显著地降低了这些反应单元中背景序列和抑制物对反应的干扰。另外，dPCR在对每个反应单元进行结果判读时仅判断阳性／阴性两种状态，不依赖于Ct值，受扩增效率的影响大为降低，对背景序列和抑制物的耐受能力也大大提高。(4)绝对定量。PCR直接计算目的序列的拷贝数，无需依赖于ct值和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测。JAK2即JanusKinase2,是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶，受到JAK基因家族的编码调控。JAK2酪氨酸激酶信号通路是细胞分化中一种主要的细胞因子信号传导通路。细胞因子与JAK2结合使其活化，从而激活下游STAT蛋白，由STAT蛋白将信号导入细胞核内，从而起到调控基因表达的作用，参与造血系统、免疫系统等多条信号通路。然而，JAK2激酶的持续激活，会导致下游STAT蛋白的持续激活，继而便诱发骨髓增殖性肿瘤(MPN)等多种肿瘤。骨髓增殖性肿瘤(Myeloproliferativeneoplasms，MPN)主要包括真性红细胞增多症(Polycythemiavera，PV)、原发性血小板增生多症(Essentialthrombocythemia，ET)、原发骨髓纤维化(Primarymyelofibrosis，PMF)、慢性粒细胞性白血病(Chronicmyelogenousleukemia，CML)。研究表明，骨髓增殖性肿瘤（MPN）通常伴有JAK2基因1849位点（G/T）突变，导致该蛋白第617位的缬氨酸(V)改变为苯丙氨酸(F)，从而引起一系列病变。在PV患者中JAK2-V617F大约有90%-95%的突变率，而在ET和PMF中突变率约为50-60%。2008年，世界卫生组织(WHO)明确将JAK2-V617F的突变作为MPN主要诊断指标之一。（ATefferi1andJWVardiman,Classificationanddiagnosisofmyeloproliferativeneoplasms:The2008WorldHealthOrganizationcriteriaandpoint-of-carediagnosticalgorithms）。因此，检测JAK2-V617F突变对MPN患者的诊断具有重要的临床意义。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题和需求，本专利技术的目的是提供一种基于数字PCR平台JAK2V617F基因突变的检测方法，应用数字PCR平台的低丰度检出率、高灵敏度、高特异性的优势，提高对基因突变位点的检出性能，以便更好的满足科研及临床的要求。技术方案：为了实现上述目的，本专利技术提供一种基于数字PCR平台JAK2V617F基因突变的检测方法：所述检测方法包括如下步骤：（1）制备数字PCR反应混合液：含有待检测基因DNA模板的样品、JAK2基因的V617F位点正向和反向扩增引物、JAK2基因的V617F位点标记TaqMan探针、内参基因B2M正向和反向扩增引物、内参基因B2M标记TaqMan探针、以及PCR反应预混液混合，制备得到数字PCR反应混合液；（2）制备数字PCR反应芯片；（3）进行数字PCR扩增程序；（4）进行PCR芯片荧光信号读取；（5）数据分析和结果统计。优选地，所述步骤（1）中设计的JAK2基因的V617F位点正向和反向扩增引物包括用于扩增JAK2基因的V617F位点的特异性引物对，所述特异性引物对包含一条正向引物SEQIDNos：1和一条反向引物SEQIDNos：2，正向引物SEQIDNos：1的序列为：CAGGTGTTATGGGTCAAGC，反向引物SEQIDNos：2的序列为：GACACCTAGCTGTGATCCTG。优选地，所述步骤（1）中JAK2基因的V617F位点标记TaqMan探针包含一条可以特异性杂交JAK2基因的V617F位点扩增区域的探针SEQIDNos：3，探针SEQIDNos：3特异性杂交突变型扩增产物，SEQIDNos：3的序列为：TAGTTTTACTTACTC。优选地，所述步骤（1）中设计的内参基因正向和反向扩增引物包括用于扩增内参基因B2M的特异性引物对，所述特异性引物对包含一条正向引物SEQIDNos：4和一条反向引物SEQIDNos：5，正向引物SEQIDNos：4的序列为：CACTGAATTCACCCCCACTG，反向引物SEQIDNos：5的序列为：AAGCAGAATTTGGAATTCATCC。优选地，所述步骤（1）中的内参基因标记TaqMan探针包含一条可以特异性杂交内参基因B2M扩增区域的探针SEQIDNos：6，探针SEQIDNos：6序列为：ATGGAGGTTTGAAGA。优选地，JAK2基因的V617F位点SEQIDNos：3特异性杂交突变型扩增产物的探针标记的荧光素为FAM。优选地，内参基因B2M标记TaqMan探针标记的荧光素为VIC。优选地，所述步骤（3）的数字PCR扩增程序为：95℃热启动，10分钟；94℃变性，30秒；60℃退火，60秒；扩增40个循环；98℃酶失活，10分钟；4℃保温。与现有本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于数字PCR平台JAK2V617F基因突变的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：（1）制备数字PCR反应混合液：含有待检测基因DNA模板的样品、JAK2基因的V617F位点正向和反向扩增引物、JAK2基因的V617F位点标记TaqMan 探针、内参基因B2M正向和反向扩增引物、内参基因B2M标记TaqMan探针、以及PCR 反应预混液混合，制备得到数字PCR反应混合液；（2）制备数字PCR反应芯片；（3）进行数字PCR扩增程序；（4）进行PCR芯片荧光信号读取；（5）数据分析和结果统计。

【技术特征摘要】
1.一种基于数字PCR平台JAK2V617F基因突变的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括如下步骤：（1）制备数字PCR反应混合液：含有待检测基因DNA模板的样品、JAK2基因的V617F位点正向和反向扩增引物、JAK2基因的V617F位点标记TaqMan探针、内参基因B2M正向和反向扩增引物、内参基因B2M标记TaqMan探针、以及PCR反应预混液混合，制备得到数字PCR反应混合液；（2）制备数字PCR反应芯片；（3）进行数字PCR扩增程序；（4）进行PCR芯片荧光信号读取；（5）数据分析和结果统计。2.根据权利要求1所述的基于数字PCR平台JAK2V617F基因突变的检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中设计的JAK2基因的V617F位点正向和反向扩增引物包括用于扩增JAK2基因的V617F位点的特异性引物对，所述特异性引物对包含一条正向引物SEQIDNos：1和一条反向引物SEQIDNos：2，正向引物SEQIDNos：1的序列为：CAGGTGTTATGGGTCAAGC，反向引物SEQIDNos：2的序列为：GACACCTAGCTGTGATCCTG。3.根据权利要求1所述的基于数字PCR平台JAK2V617F基因突变的检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中JAK2基因的V617F位点标记TaqMan探针包含一条可以特异性杂交JAK2基因的V617F位点扩增区域的探针SEQIDNos：3，探针SEQIDNos：3特异性杂交突变型扩增产物，SEQIDNos：3的序列为：TAGTTTT...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽英，
申请(专利权)人：张丽英，
类型：发明
国别省市：内蒙古,15