用于结直肠癌诊断的外泌体miRNA标志物及诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术提供用于结直肠癌诊断的外泌体miRNA标志物，所述标志物选自let‑7b‑3p、let‑7b‑5p、miR‑150‑3p、miR‑145‑3p、miR‑139‑3p、miR‑139‑5p、miR‑15b‑3p、miR‑125a‑5p、miR‑140‑5p、miR‑342‑3p、miR‑132‑5p和miR‑92b‑5p中的至少一种。本发明专利技术还提供用于结直肠癌诊断的试剂盒。本发明专利技术还建立了用于检测所述miRNA标志物的方法。本发明专利技术基于无创检测技术开发的结直肠癌诊断及复发监控的方法，在早期结直肠癌中具有高灵敏度及高特异性，多个miRNA标志物联合AUC最高可达0.99，具有极其优越的诊断性能。

Exosome microRNA markers and diagnostic kits for colorectal cancer

【技术实现步骤摘要】
用于结直肠癌诊断的外泌体miRNA标志物及诊断试剂盒
本专利技术涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种用于结直肠癌诊断的外泌体miRNA标志物及诊断试剂盒。
技术介绍
结肠直肠癌(carcinomaofcolonandrectum)是胃肠道中常见的恶性肿瘤，早期症状不明显，随着癌肿的增大而表现排便习惯改变、便血、腹泻、腹泻与便秘交替、局部腹痛等症状，晚期则表现贫血、体重减轻等全身症状。其发病率和病死率在消化系统恶性肿瘤中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌。我国结直肠癌(Colorectalcancer，CRC)的发病率和死亡率均保持上升趋势。2015年中国癌症统计数据显示：我国结直肠癌发病率、死亡率在全部恶性肿瘤中均位居第5位，其中新发病例37.6万，死亡病例19.1万。其中，城市地区远高于农村，且结肠癌的发病率上升显著。多数患者发现时已属于中晚期。因此，为提升我国结直肠癌诊疗行为，改善结直肠癌患者预后，结直肠癌的早诊早治成为结直肠癌诊治的重要问题。目前结直肠癌的诊断手段主要是内镜检查。内镜检查会给受检者带来一定的痛苦，而且有一些特定群体难以耐受(如急性腹膜炎、肠穿孔患者等)，所以能够接受及覆盖的群体有限。也有采用血液septin9甲基化检测的基于血液的无创检测手段，但其检测的灵敏度并不高；因此，亟待开发一种高灵敏度的无创结直肠癌早期检测的方法。细胞外囊泡(ExtracellularVesicles,EVs；以下囊泡均代表细胞外囊泡)是指从细胞膜上脱落或由细胞分泌的具有双层膜结构的囊泡状小体，直径从30-1000nm不等，胞外囊泡主要由微囊泡(MicroVesicles,MVs)和外泌体(exosomes)组成，微囊泡是细胞激活或损伤后从细胞膜脱落的小囊泡。由于细胞外囊泡独特的生物学特征，其在疾病诊断中有着重要的意义，特别是其中的外泌体。外泌体是一种由细胞内多泡体与细胞膜融合后分泌到细胞外环境中粒径介于30～150nm的膜性小囊泡，是细胞间信息传递的重要媒介，在抗原呈递、细胞凋亡、炎症反应、肿瘤发生发展及转移过程中发挥了重要作用。其在体液中分布广泛，包括血液、唾液、尿液、乳汁和胸腹水等；包含DNA、RNA及蛋白质等多种内含物，可以作为肿瘤等多种疾病的无创诊断标志物。而miRNA则是外泌体中含量最为丰富的核酸组分，因而外泌体miRNA具备作为结直肠癌早期诊断的潜力。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供用于结直肠癌诊断的外泌体miRNA标志物及其组合。本专利技术的另一目的是提供基于所述外泌体miRNA标志物开发的用于结直肠癌诊断的试剂盒。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供用于结直肠癌诊断的外泌体miRNA标志物，其特征在于，所述miRNA标志物选自let-7b-3p、let-7b-5p、miR-150-3p、miR-145-3p、miR-139-3p、miR-139-5p、miR-15b-3p、miR-125a-5p、miR-140-5p、miR-342-3p、miR-132-5p和miR-92b-5p中的至少一种。优选地，所述miRNA标志物为以下(i)～(vii)中任一个：(i)let-7b-3p、miR-15b-3p、miR-140-5p、miR-342-3p、miR-132-5p或miR-92b-5p；(ii)let-7b-3p、miR-139-3p和miR-145-3p；(iii)let-7b-3p、miR-139-3p、miR-145-3p和miR-125-5p；(iv)miR-139-3p和miR-15b-3p；(v)let-7b-3p和miR-15b-3p；(vi)miR-139-3p、miR-145-3p和miR-15b-3p；(vii)let-7b-3p、let-7b-5p、miR-150-3p、miR-145-3p、miR-139-3p、miR-139-5p、miR-15b-3p、miR-125a-5p、miR-140-5p、miR-342-3p、miR-132-5p和miR-92b-5p。在一些优选的实施方案中，显著差异表达的miRNA分子标志物联合使用，其中较优的组合是：(1)miR-15b-3p和miR-139-3p；(2)Let-7b-3p和miR-15b-3p；(3)miR-139-3p、miR-145-3p和miR-15b-3p；(4)let-7b-3p、miR-139-3p和miR-145-3p；(5)let-7b-3p、miR-139-3p、miR-145-3p和miR-125-5p；(6)let-7b-3p、let-7b-5p、miR-150-3p、miR-145-3p、miR-139-3p、miR-139-5p、miR-15b-3p、miR-125a-5p、miR-140-5p、miR-342-3p、miR-132-5p和miR-92b-5p。上述组合可为结直肠癌的诊断、预后判断、疗效检测和复发监控提供更好的依据，预示疾病风险。本专利技术提供的用于结直肠癌诊断、预后判断、疗效监测及复发监控的miRNA标志物检测样本为外泌体。所述外泌体来源于血液、尿液、唾液及痰液的一种或多种。除了外泌体，本专利技术的miRNA标志物同样适用于结直肠癌患者的其它组织、器官、细胞及体液。第二方面，本专利技术提供用于检测所述miRNA标志物的引物，对应于各miRNA，包括逆转录引物、上游引物和通用下游引物；其中，所述逆转录引物为特异性颈环结构逆转录引物。用于检测let-7b-3p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6和SEQIDNO.1所示；用于检测let-7b-5p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.1所示；用于检测miR-150-3p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.8、SEQIDNO.9和SEQIDNO.1所示；用于检测miR-145-3p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.11、SEQIDNO.12和SEQIDNO.1所示；用于检测miR-139-3p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.14、SEQIDNO.15和SEQIDNO.1所示；用于检测miR-139-5p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.17、SEQIDNO.18和SEQIDNO.1所示；用于检测miR-15b-3p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.20、SEQIDNO.21和SEQIDNO.1所示；用于检测miR-125a-5p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.23、SEQIDNO.24和SEQIDNO.1所示；用于检测miR-140-5p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.26、SEQIDNO.27和SEQIDNO.1所示；用于检测miR-342-3p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.29、SEQIDNO.30和SEQID本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于结直肠癌诊断的外泌体miRNA标志物，其特征在于，所述miRNA标志物选自let‑7b‑3p、let‑7b‑5p、miR‑150‑3p、miR‑145‑3p、miR‑139‑3p、miR‑139‑5p、miR‑15b‑3p、miR‑125a‑5p、miR‑140‑5p、miR‑342‑3p、miR‑132‑5p和miR‑92b‑5p中的至少一种。

【技术特征摘要】
1.用于结直肠癌诊断的外泌体miRNA标志物，其特征在于，所述miRNA标志物选自let-7b-3p、let-7b-5p、miR-150-3p、miR-145-3p、miR-139-3p、miR-139-5p、miR-15b-3p、miR-125a-5p、miR-140-5p、miR-342-3p、miR-132-5p和miR-92b-5p中的至少一种。2.根据权利要求1所述的miRNA标志物，其特征在于，所述miRNA标志物为以下(i)～(vii)中任一个：(i)let-7b-3p、miR-15b-3p、miR-140-5p、miR-342-3p、miR-132-5p或miR-92b-5p；(ii)let-7b-3p、miR-139-3p和miR-145-3p；(iii)let-7b-3p、miR-139-3p、miR-145-3p和miR-125-5p；(iv)miR-139-3p和miR-15b-3p；(v)let-7b-3p和miR-15b-3p；(vi)miR-139-3p、miR-145-3p和miR-15b-3p；(vii)let-7b-3p、let-7b-5p、miR-150-3p、miR-145-3p、miR-139-3p、miR-139-5p、miR-15b-3p、miR-125a-5p、miR-140-5p、miR-342-3p、miR-132-5p和miR-92b-5p。3.用于检测权利要求1或2所述miRNA标志物的引物，其特征在于，对应于各miRNA，包括逆转录引物、上游引物和通用下游引物；其中，用于检测let-7b-3p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6和SEQIDNO.1所示；用于检测let-7b-5p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3和SEQIDNO.1所示；用于检测miR-150-3p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.8、SEQIDNO.9和SEQIDNO.1所示；用于检测miR-145-3p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.11、SEQIDNO.12和SEQIDNO.1所示；用于检测miR-139-3p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.14、SEQIDNO.15和SEQIDNO.1所示；用于检测miR-139-5p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO.17、SEQIDNO.18和SEQIDNO.1所示；用于检测miR-15b-3p的逆转录引物、上游引物和通用下游引物的...

【专利技术属性】
技术研发人员：闵力，孔关义，朱圣韬，刘翔，赵立波，陈苏红，张澍田，
申请(专利权)人：北京恩泽康泰生物科技有限公司，首都医科大学附属北京友谊医院，
类型：发明
国别省市：北京,11