一种用于检测宫颈癌易感性的分子标记、试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测宫颈癌易感性的分子标记、试剂盒及应用，属于分子生物学与生物医药技术领域。所述分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，在第501位存在单核苷酸多态性：G>C或者G>T，即此序列的第501位的碱基包括碱基G、碱基C和碱基T三种情况。本发明专利技术提供的试剂盒具有基于NEIL2基因单核苷酸多态性设计的三对特异性引物，NEIL2基因单核苷酸多态性与宫颈癌易感性密切相关，利用PCR技术可以有效检测NEIL2基因中的单核苷酸多态性，进而鉴别宫颈癌易感性，这对于宫颈癌高危人群的筛选和易感个体的检测，对宫颈癌这个复杂性疾病进行早期预防、早期诊断和个性化防治具有重要的现实意义。

A molecular marker, kit and application for detecting susceptibility to cervical cancer

The invention discloses a molecular marker, a kit and an application for detecting susceptibility of cervical cancer, belonging to the technical field of molecular biology and biomedicine. As shown in SEQ ID NO.1, there is a single nucleotide polymorphism at position 501: G > C or G > T. That is to say, the 501st nucleotide base of the sequence includes three cases: base G, base C and base T. The kit provided by the invention has three pairs of specific primers designed based on the single nucleotide polymorphism of NEIL2 gene. The single nucleotide polymorphism of NEIL2 gene is closely related to the susceptibility of cervical cancer. The single nucleotide polymorphism of NEIL2 gene can be effectively detected by using PCR technology, and then the susceptibility of cervical cancer can be identified. This is useful for screening high-risk population of cervical cancer and detection of susceptible individuals. Early prevention, early diagnosis and individualized prevention of cervical cancer, a complex disease, are of great practical significance.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测宫颈癌易感性的分子标记、试剂盒及应用
本专利技术涉及分子生物学与生物医药
，具体涉及一种用于检测宫颈癌易感性的分子标记及其应用。
技术介绍
宫颈癌是全世界妇女中第四常见的癌症，估计每年有529572例新诊断病例和274967例死亡。同时宫颈癌也是全世界妇女癌症相关死亡的第三大原因，而且发病率一直在升高。在中国，除了乳腺癌之外，宫颈癌已经成为女性最常见的癌症(98.9/100000)，死亡率高达30.5/100000，发病率也在上升。高危型人乳头瘤病毒(HPV)是宫颈癌发生的主要病因，然而，尽管大约80％的妇女一生中都可能HPV感染，但只有一小部分发展为恶性肿瘤。根据流行病学调查以及现代分子遗传学研究发现，这种现象必然和个体的遗传学背景有关，不同遗传学背景的个体对宫颈癌的易感性是完全不同的。而且宫颈癌的发病从HPV感染到细胞恶性转化，最后到最终病理学诊断为恶性肿瘤的病理周期可以长达十年以上，这期间有漫长的癌前病变时间，这提示我们如果能够做到早期诊断，早期预防，早期治疗，那么宫颈癌患者的治疗效果和预后就能得到明显的提高。因此探讨宫颈癌发生发展的分子生物学机制，探寻用于鉴定宫颈癌遗传学易感人群的分子标记，宫颈癌患者分子分型和预后预测的分子标记，对于发现宫颈癌易感人群及宫颈癌患者实施有效的早期诊断和个体化治疗具有重要的预防和临床意义。目前研究主要方向在于发现宫颈癌的易感基因和遗传变异，但这些遗传变异只能解释一小部分宫颈癌的遗传易感性。因此，需要更为深入和细致的遗传研究，进一步理解宫颈癌的遗传易感性。基因组DNA修复系统参与维持基因组的完整性和稳定性，以应对环境攻击、复制错误和累积遗传学错误。在人类中，五种主要的DNA修复途径帮助修复受损的DNA，包括直接逆转、碱基切除修复(BER)、核苷酸切除修复、错配修复和重组修复，其中100多个基因参与了这个过程。其中NEIL1和NEIL2两个基因遗传变异可能影响蛋白质功能，导致细胞命运的改变和增加致癌风险，但并没有文献报道这两个基因中的SNP位点和宫颈癌易感性相关。因此，本领域急需进一步找寻宫颈癌易感性相关遗传学分子标记，开发检测宫颈癌高危人群和易感个体的方法、试剂盒和检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于鉴别宫颈癌易感性的分子标记，并由此开发出用于检测宫颈癌易感性的试剂盒和检测方法，为发现宫颈癌易感人群及宫颈癌患者实施有效的早期诊断和个体化治疗提供检测方法。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种用于检测宫颈癌易感性的分子标记，其核苷酸序列如SEQIDNO.1(rs804270)所示，在第501位存在单核苷酸多态性：G>C或者G>T，即此序列的第501位的碱基包括碱基G、碱基C和碱基T三种情况。当为碱基G时表现为正常的NEIL2基因遗传状态，当为碱基C或者碱基T时，表现为异常或者错误的NEIL2基因遗传状态。本专利技术针对大量候选基因的SNP位点在宫颈癌大样本量标本中进行了检测和分析，首次发现了NEIL2(neilikeDNAglycosylase2)基因和宫颈癌易感性密切相关，研究结果表明SEQIDNO:1(rs804270)中的501G>C和宫颈鳞状细胞癌的发病存在显著相关性，并且这种相关性在其癌前病变CINIII期间已经有所表现，501CC纯合子个体罹患CINIII和宫颈鳞状细胞癌的风险明显提高，因此可以作为宫颈癌遗传易感性检测和早期诊断的分子标记。本专利技术还提供了所述的分子标记作为检测靶点在制备检测宫颈癌易感性试剂盒中的应用。作为上述分子标记的应用，本专利技术提供了一种用于检测宫颈癌易感性的试剂盒，所述试剂盒包括：用于检测所述的分子标记的特异性引物。针对上述SNP位点的碱基多态性，本专利技术设计并合成了三条特异性的上游引物，和一条特异性的下游引物，每一条特异性上游引物分别对应相应的G、C、T碱基序列，分别和下游引物作PCR特异性扩增，扩增产物长度为317bp，根据相应配对引物扩增的PCR阳性条带判断对应碱基的型态是纯合子还是杂合子。同时为提高检测的特异性，在设计上游引物时把上游引物的3’端倒数第二个碱基设计为与互补链相同的碱基，而不是互补的碱基，这能避免非特异性条带的出现，保证了检测结果的特异性。具体地，所述PCR引物序列为：上游引物1:5’-CCCCCGGGCAGGGAGGGCGG-3’(SEQIDNO:2)；上游引物2:5’-CCCCCGGGCAGGGAGGGCGC-3’(SEQIDNO:3)；上游引物3:5’-CCCCCGGGCAGGGAGGGCGT-3’(SEQIDNO:4)；下游引物:5’-GACAAAACCGCCAGGCTGGA-3’(SEQIDNO:5)。所述试剂盒还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括dNTP混合液、TaqDNA聚合酶和PCR缓冲液。PCR反应液中各组分之间的用量关系为常规PCR条件下的比例，对所属领域技术人员是常规知识。作为上述试剂盒的应用，本专利技术还提供了一种检测体外样本是否存在NEIL2基因的单核苷酸多态性的方法，包括以下步骤：(1)提取体外样本的基因组DNA，作为模板，利用NEIL2基因特异性引物进行PCR扩增得到PCR扩增产物，所述NEIL2基因特异性引物为三对，其核苷酸序列分别为SEQIDNO.2和SEQIDNO.5、SEQIDNO.3和SEQIDNO.5、SEQIDNO.4和SEQIDNO.5；(2)将PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，根据电泳结果，判断扩增产物是否存在以下的单核苷酸多态性：501G>C或者501G>T，突变位置编号是基于SEQIDNO:1的序列，进而确定体外样本的NEIL2基因相应位点是否存在单核苷酸多态性。应用本专利技术提供的试剂盒对宫颈癌遗传易感性个体进行患病风险检测和诊断时，与正常的NEIL2基因进行比较，如存在差异，即存在单核苷酸多态性：501G>C，则表明该个体罹患宫颈癌的风险可能高于正常人群。本专利技术具备的有益效果：本专利技术提供了一种用于检测宫颈癌易感性的检测试剂盒，试剂盒中具有基于NEIL2基因单核苷酸多态性设计的三对特异性引物，NEIL2基因单核苷酸多态性rs804270与宫颈癌易感性密切相关，利用PCR技术可以有效检测NEIL2基因中的单核苷酸多态性，该方法检测简单、快捷、特异性高，同时费用低廉、无需特殊的DNA测序设备，便于在各级临床医院推广应用，这对于宫颈癌高危人群的筛选和易感个体的检测，对宫颈癌这个复杂性疾病进行早期预防、早期诊断和个性化防治具有重要的现实意义。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。以下的实施例中采用的方法目的是更好地理解本专利技术，但并不限于本专利技术。如无特殊说明，实施例中涉及的实验方法均为常规方法，所用的实验材料均为常规试剂公司购买。实施例1.NEIL2基因单核苷酸多态性检测和宫颈癌易感性的关联分析1.1研究对象随机选取宫颈鳞状细胞癌患者400例，以及宫颈癌癌前病变CINIII病例400例，选取病例时间为2004年6月到2008年12月，来源自浙江大学医学院附属妇产科医院经病理明确诊断的病例，同时选择1200例正常体检的女性志愿者作为正常对照，正常对照的入选标准为无病理细胞学发现、无子宫内膜异位本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测宫颈癌易感性的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，在第501位存在单核苷酸多态性：G>C或者G>T，即此序列的第501位的碱基包括碱基G、碱基C和碱基T三种情况。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测宫颈癌易感性的分子标记，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，在第501位存在单核苷酸多态性：G>C或者G>T，即此序列的第501位的碱基包括碱基G、碱基C和碱基T三种情况。2.如权利要求1所述的分子标记作为检测靶点在制备检测宫颈癌易感性试剂盒中的应用。3.一种用于检测宫颈癌易感性的试剂盒，其特征在于，包括：用于检测如权利要求1所述的分子标记的特异性引物。4.如权利要求3所述的用于检测宫颈癌易感性的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物为三对，每个引物对包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2、SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示，所述下游引物如SEQIDNO.5所示。5.如权利要求3所述的用于检测宫颈癌易感性的试剂盒，其特征在于...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈怀增，叶枫，王浛知，洪蝶，程琪，周彩云，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33