一种新型肿瘤药物敏感性检测方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种新型肿瘤药物敏感性测试方法及其应用，利用圆锥形孔底培养板培养肿瘤组织块，培养孔里加入肿瘤细胞培养液、肿瘤组织相邻细胞以及促进血管生长的因子（Afgf、bFGF、PD‑ECGF、TGF、TNF、VEGF），最大程度维持了肿瘤组织在体内的状态，为肿瘤药物体外敏感性研究提供了一种新型的方法，同时为细胞体外三维培养也奠定了新的思路，该成果有较强的理论意义和应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及肿瘤体外药敏检测领域，具体涉及一种新型肿瘤组织三维培养方法，尤其涉及药物敏感性检测方法及应用。
技术介绍
目前,肿瘤药敏试验已发展为体内和体外两大系列10多种药敏试验,包括分离肿瘤单细胞体外培养法(MTT、MTS、ATP等不同检测方法)、裸鼠移植瘤模型法、胶原凝胶包埋培养法和微组织块培养法等。四甲基偶氮唑盐比色法(methylthiazolyltetrazoliumassay，MTT)是目前最常用的体外药敏试验方法。其原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能脱下琥珀酸的氢原子，将可溶性的黄色唑盐还原为不可溶的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)，并沉积在细胞中。盐酸异丙醇或二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm或570nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。三磷酸腺苷生物荧光法(ATP－TCA)法，利用ATP水平与活细胞数量呈正相关，能显示细胞代谢的活跃程度，间接提供细胞增殖活性。三磷酸腺苷生物荧光法(adenosinetriphosphatetumorchemosensitivityassay，ATP－TCA)的原理是在肿瘤细胞与药物充分作用后，加入荧光色素－荧光色素酶复合物，ATP与之结合并产生荧光，通过检测荧光强度来计算ATP的含量，进而可反映活细胞数。HTCA法原理为测定肿瘤细胞中的干细胞在药物作用下形成集落能力的变化。TECIA法由组织培养药物敏感性试验法(HDRA)演化而来。HDRA原理为:在体外培养肿瘤组织块并加入抗肿瘤药物，早期用放射标记物前体掺入，改良后的以MTT法观察组织块对抗癌药物的敏感程度，并引入计算机图像分析技术，形成组织培养－终点染色－计算机图像分析法即(TECIA)，进一步简化了试验步骤。流式细胞仪测定法，用于药敏检测试验是一种较为简单、快捷的方法，由于抗肿瘤药物实质上是通过诱导肿瘤细胞凋亡产生抗肿瘤效应的，流式细胞仪则通过测定细胞凋亡率反映药物对肿瘤细胞的抑制情况。
技术实现思路
一种新型肿瘤药物敏感性检测方法，其特征在于，在无菌条件下取肿瘤及其周边组织，利用锥形孔底培养板培养肿瘤组织块，在药敏试验时，加入促进血管生成的因子、肿瘤组织周边细胞以及肿瘤细胞培养液，摸索出新的肿瘤组织块三维培养方法以及适宜的培养液各成分浓度，所述方法包括以下步骤：1)获取恶性肿瘤及周边组织，用生理盐水冲洗，整个过程严格无菌；2)用含抗生素的无血清细胞培养液进行药物灭菌；3)把灭菌后的肿瘤组织块及周边组织取出，在无菌条件下剪成小块，用缓冲液清洗，加入小牛血清、抗生素、培养液、以及促血管生长因子和少量周边组织；4)培养一天后，测定肿瘤组织初始面积，与药物共培养后，加入MTT培养3小时，测定并计算出抑制率。本专利技术的目的通过以下技术方案实现。一种新型肿瘤药物敏感性检测方法及其应用，包括以下步骤：1.手术切除的恶性肿瘤及其周边组织，大小在1cm3—3cm3之间，用生理盐水冲洗2-3次后，放入含有培养基(无血清RPMI-1640)的无菌标本瓶送检，整个过程严格无菌。2.灭菌：用无血清RPMI-1640培养液，含青霉素G钠100U/ml--400U/ml、硫酸链霉素100μg/ml--400μg/ml、硫酸庆大霉素10μg/ml--200μg/ml和二性霉素B1μg/ml--5μg/ml进行药物灭菌5--30min。3.把灭菌后的肿瘤组织块及其周边组织取出，在无菌条件下剪成0.5--2mm3的小块，用PBS缓冲液清洗组织块2--4次。4.用含5％--20％小牛血清、青霉素G钠50U/ml--200U/ml和硫酸链霉素100μg/ml的RPMI-1640营养液培养24h。5.测定初始面积。6.药物共培养：利用4步中的培养液配置化疗药物到药物血液峰值的浓度，培养4d。7.MTT染色：培养4d后，加入MTT染色培养3h后，测定标本面积。8.计算肿瘤抑制率：Si＝[S始－S终]/S始×[S0终/S0始]×100％Si药物肿瘤抑制率，S0始无加药空白对照组始面积，S0终无加药空白对照组终面积，S始加药试验组始面积，S终加药试验组终面积。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：本专利技术以圆锥形孔底容器培养肿瘤组织块，使得肿瘤组织块与加入的相邻细胞能够很好形成团状，有利于细胞之间的交流，使肿瘤组织获得极好的三维培养环境。本专利技术的培养液，加入了促血管生长因子，模拟了肿瘤组织在体内有大量血管的状态，在做体外药敏时，肿瘤组织状态更加接近体内。本专利技术培养肿瘤组织块的方法，为细胞三维培养打开了新的思路，有利于了解细胞相互之间的作用对细胞生长的影响。具体实施方式实施例1：一种检测鼻咽癌化疗药物敏感性方法，包括模拟鼻咽瘤在体内的基膜结构及肿瘤的血供系统。手术切除鼻咽瘤及其周边组织，大小为1cm3，用生理盐水冲洗3次后，放入含有培养基(无血清RPMI-1640)的无菌标本瓶送检，整个过程严格无菌。用无血清RPMI-1640培养液，含青霉素G钠200U/ml、硫酸链霉素200μg/ml、硫酸庆大霉素100μg/ml和二性霉素B2.5μg/ml进行药物灭菌15min。把灭菌后的肿瘤组织块及周边组织取出，在无菌条件下剪成1mm3的小块，用PBS缓冲液清洗组织块3次，并分成3组，每组里面1个鼻咽癌组织块。用含10％小牛血清、青霉素G钠100U/ml、硫酸链霉素100μg/ml的RPMI-1640营养液，总共1ml，培养24h。测定初始面积。利用【0015】步中的培养液，每组加入VEGF10ng/ml、Bfgf10ng/ml和TNF20ng/ml，配置DDP、5FU、平阳霉素，浓度分别为5mg/ml、100mg/ml、10mg/ml，分别加入不同的三组，培养4d。培养4d后，加入MTT染色培养3h后，测定标本重点面积。计算肿瘤抑制率：Si＝[S始－S终]/S始×[S0终/S0始]×100％最终测得5FU组的抑制率为73％，DDP的抑制率27％，平阳霉素的抑制率13％，综合临床一致性82％。实施例2：一种检测卵巢癌化疗药物敏感性方法，包括模拟卵巢瘤在体内的基膜结构及肿瘤的血供系统。手术切除卵巢瘤及其周边组织，大小为1cm3，用生理盐水冲洗3次后，放入含有培养基(无血清RPMI-1640)的无菌标本瓶送检，整个过程严格无菌。用无血清RPMI-1640培养液，含青霉素G钠200U/ml、硫酸链霉素200μg/ml、硫酸庆大霉素100μg/ml和二性霉素B2.5μg/ml进行药物灭菌15min。把灭菌后的肿瘤组织块及周边组织取出，在无菌条件下剪成1mm3的小块，用PBS缓冲液清洗组织块3次，并分成3组，每组里面1个鼻咽癌组织块。用含10％小牛血清、青霉素G钠100U/ml、硫酸链霉素100μg/ml的RPMI-1640营养液，总共1ml，培养24h。测定初始面积。利用【0015】步中的培养液，每组加入VEGF15ng/ml、Bfgf16ng/ml和TNF10ng/ml，配置紫杉醇、卡珀、草酸珀+波尔定，浓度分别为10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml，分别加入不同的三组，培养4d。培养4d后，加入MTT染色培养3h后，测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新型肿瘤药物敏感性检测方法，其特征在于，在无菌条件下取肿瘤及其周边组织，利用锥形孔底培养板培养肿瘤组织块，在药敏试验时，加入促进血管生成的因子、肿瘤组织周边细胞以及肿瘤细胞培养液，摸索出新的肿瘤组织块三维培养方法以及适宜的培养液各成分浓度，所述方法包括以下步骤：获取恶性肿瘤及周边组织，用生理盐水冲洗，整个过程严格无菌；用含抗生素的无血清细胞培养液进行药物灭菌；把灭菌后的肿瘤组织块及周边组织取出，在无菌条件下剪成小块，用缓冲液清洗，加入小牛血清、抗生素、培养液、以及促血管生长因子和少量周边组织；培养一天后，测定肿瘤组织初始面积，与药物共培养后，加入MTT培养3小时，测定并计算出抑制率。

【技术特征摘要】
1.一种新型肿瘤药物敏感性检测方法，其特征在于，在无菌条件下取肿瘤及其周边组织，利用锥形孔底培养板培养肿瘤组织块，在药敏试验时，加入促进血管生成的因子、肿瘤组织周边细胞以及肿瘤细胞培养液，摸索出新的肿瘤组织块三维培养方法以及适宜的培养液各成分浓度，所述方法包括以下步骤：获取恶性肿瘤及周边组织，用生理盐水冲洗，整个过程严格无菌；用含抗生素的无血清细胞培养液进行药物灭菌；把灭菌后的肿瘤组织块及周边组织取出，在无菌条件下剪成小块，用缓冲液清洗，加入小牛血清、抗生素、培养液、以及促血管生长因子和少量周边组织；培养一天后，测定肿瘤组织初始面积，与药物共培养后，加入MTT培养3小时，测定并计算出抑制率。2.根据权利要求1所述的新型肿瘤药物敏感...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄旭东，张灿，
申请(专利权)人：成都无界精准生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51