一种评价破骨细胞骨吸收功能的方法技术

本发明专利技术提供了一种评价破骨细胞骨吸收功能的方法，所述方法是将长径小于30μm的骨粉固定于细胞培养板的底面，通过对培养前后定点照片的光密度分析，比较培养前后细胞培养板的透光度，从而反映细胞培养板内骨粉被吸收的程度，以评价破骨细胞的骨吸收功能。本发明专利技术的方法更加简便，克服了破骨细胞选择性吸附的问题，结果更加稳定、可靠，具备良好的可操作性和较高的灵敏度，在破骨细胞溶骨活性检测相关的研究中具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体地说，涉及一种评价破骨细胞骨吸收功能的方法及其应用。
技术介绍
骨质疏松是目前老龄化社会的常见病和多发病。骨质在新陈代谢的过程中不断的通过合成和降解进行重建，该过程由成骨细胞和破骨细胞共同作用来完成。破骨细胞在骨质代谢过程中具有十分重要的作用，其功能的过度激活在骨质疏松的发生和发展上有着较为直接的作用。破骨细胞的体外实验在骨质疏松的发病机制和治疗方式的研究中有着极为重要的作用。其中，对破骨细胞溶骨活性的评价，经常作为各种干预因素处理后的观察指标，在此类研究中有着不可或缺的作用。在既往的研究中，对破骨细胞功能的评价主要集中在三个方面。第一，通过检测破骨细胞溶骨后的代谢产物，如NTX-I、CTX-I和ICTP；第二，通过检测破骨细胞内特异性酶的含量和活性，如TRAP染色和组织蛋白酶K活性的检测；第三，通过将破骨细胞与骨片进行共培养，使用显微镜观察骨片上破骨细胞吸收陷窝的个数、面积以及深度，来评价破骨细胞的功能。以上方法中，第一、二种方法是对破骨细胞功能的间接反映，可通过该指标推测破骨细胞的功能，但影响结果的因素较多，准确性相对较差。第三种方法可以直接的反映破骨细胞的溶骨功能，并可以通过对吸收陷窝的个数、面积以及深度差异的分析，比较溶骨功能的强弱，是目前使用较为广泛，结果也较为准确的方法，但该方法在使用的过程中存在较大的限制。第一，骨片的制备。骨片制备的困难是限制该方法使用的重要原因。以使用牛骨制备骨片为例，首先需将牛股骨洗净，刮除表面肌腱、韧带和内面的骨髓，将骨皮质纵行切开，用骨皮质制成一条圆柱形骨棒。然后使用重型切片机，将骨棒切成100μm左右的骨薄片并用剪刀将其剪切到目的大小，最后将骨薄片磨成10～50μm后置于75％酒精或者双抗中备用。其中，骨片的打磨过程困难，成功率较为有限，使骨片的大量制备可行性不高。同时，国内重型切片机的缺乏也是一个重要的限制。此外，受骨皮质厚度的限制，骨棒的直径一般为10mm左右，因此只适用于48孔或者96孔细胞培养板。第二，骨片的使用。骨片在使用过程中，首先遇到的问题是无法承受高温灭菌，只能通过酒精或着双抗浸泡和紫外线照射的方法灭菌，培养时污染的可能性相对增加。其次，由于破骨细胞有着趋于远离骨片的特性，使得其不易附着于骨片表面，而常常聚集在骨片周围和骨片下。又由于人工剪切骨片的水平有限，并不能使骨片和培养孔的大小十分一致。因此，种植在骨片上的细胞数量，很大程度上取决于滴加细胞时的位置和液体流速，而骨片的不透明又限制了对细胞的计数。第三，结果的分析。由于骨片上细胞数的不一致，使得用于功能比较时，基线的可比性大大降低。而骨片上细胞分布的不一致，使得在观察结果时，很大程度上取决于视野的选取。基于以上原因，目前为止，没有一种较好的方法可以检测破骨细胞的溶骨活性，极大限制了对影响破骨细胞功能因素的研究。因此，本领域亟需开发一种简单易行并且准确性较高的实验方法，以评价破骨细胞的溶骨活性。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种评价破骨细胞骨吸收功能的方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是：一种评价破骨细胞骨吸收功能的方法，所述的方法是将长径小于30μm的骨粉固定于细胞培养板的底面，通过对培养前后定点照片的光密度分析，比较培养前后细胞培养板的透光度，从而反映细胞培养板内骨粉被吸收的程度，以评价破骨细胞的骨吸收功能。优选地，所述的方法包括以下步骤：a)制板：将长径小于30μm的骨粉进行灭菌，加入酒精溶液制成骨粉混悬液，充分混匀后滴加至细胞培养板的孔中，然后将加好的细胞培养板晾干，再向孔内加入丙酮，所述丙酮的加入量与孔底面积的比例为(10-30)μl:1.75cm2，滴入丙酮后迅速翻转细胞培养板，1-10min之内在孔底做标记，待孔底完全凝固后用蒸馏水冲洗，将未固定在孔底的骨粉冲洗干净，晾干；b)培养前拍照：用显微镜于标记位置拍照，同时选取一个不做任何处理的孔作为校正孔进行拍照，以用于校正培养后拍照时因显微镜参数不一致而产生的误差；c)细胞的接种和培养：在上述细胞培养板内进行细胞的培养，接种浓度为(0.5-1.5)*105个/ml，培养时间为8-14d。d)培养后拍照：培养结束后除去细胞及残留核酸，待细胞培养板晾干后再次对标记位置和校正孔进行拍照；e)照片对比：对培养前后两次照片进行光密度分析，比较细胞培养前后细胞培养板的透光度，从而反映细胞培养板的孔内骨粉被吸收的程度。优选地，所述丙酮的加入量与孔底面积的比例为10μl:1.75cm2。优选地，步骤d)中，除去细胞的方法是采用EDTA配制的0.25％胰酶消化10-20min，再使用强RIPA裂解10-20min；或直接使用强RIPA裂解15-30min。优选地，步骤d)中，除去残留核酸的方法是先采用0.5-5mol/L的NaCl溶液清洗，再使用蒸馏水清洗。优选地，所述的骨粉由牛股骨皮质制成。但不仅限于此，其它动物股骨，或使用长骨均可。优选地，所述酒精溶液的体积浓度为70％-90％，所述骨粉混悬液的浓度在2.5mg/ml以上。优选地，步骤a)中，是使用微量移液器的枪头在孔底做标记。但不仅限于此，只要使用细小较硬头端的无菌物品都可以完成。优选地，步骤b)中，是在10×光镜下拍照。次之，在4×或者20×也是可行的。优选地，步骤e)中，所述的光密度分析具体是使用软件分析培养前后两次照片的总光密度值，除以整张照片的面积，算出平均光密度值，再利用校正孔前后平均光密度的差值的均值，校正培养后拍照所有照片的平均光密度值，校正后的培养后照片的平均光密度值与培养前照片的平均光密度值的差值即反映培养板上骨粉减少的量。本文中，所述的细胞培养板可以是96孔、48孔、24孔、12孔或6孔，但不仅限于此，也可以是任何适于细胞培养和透光度观察的培养装置。本专利技术的有益效果是提供了一种新的反映破骨细胞溶骨功能的实验方法，具体地，本专利技术的方法具备以下优点：1、更加简便，骨粉板制备十分方便，一般实验室即可完成，并且可以大量生产；2、克服了破骨细胞选择性吸附的问题；3、通过使用定点标记拍照的方式，避免了因视野选取不同而造成的结果偏倚，使结果更加稳定、可靠；4、通过使用光密度分析的方法，反映培养板孔底透光度的变化，从而评价骨粉的厚度变化，具备很好的可操作性和较高的灵敏度。本专利技术的方法在破骨细胞溶骨活性检测相关的研究中具有重要的应用价值。附图说明图1.用于制作骨粉的机器。由一个低速电机带动金刚砂轮转动，另一边使用金属圆筒固定骨棒，并用橡皮筋和一根木棒将骨棒压在砂轮上。图2.制作完成的24孔细胞培养板。细胞培养板的上面3排可用于细胞培养和分组比较。第4排第1孔作为校正孔，其余的未加入骨粉，可用于细胞诱导情况的观察，因加入骨粉后观察细胞困难。孔底可以看到用于定点拍照的标记。图3.实验前(A)与实验后(B)两次，通过定点拍摄的照片(10×)。仔细观察可以看到，两次照片相似度很高，在拍摄的位置上是一致的。图4.破骨细胞的TRAP染色(10×)。对实验中诱导的RAW264.7细胞进行TRAP染色，验证破骨细胞的诱导成功。染色阳性的细胞，胞浆内可见红色或紫红色颗粒。图5.图中，A：不同RANKL浓度组的前后光密度变化差异。B：本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种评价破骨细胞骨吸收功能的方法，其特征在于，所述的方法是将长径小于30μm的骨粉固定于细胞培养板的底面，通过对培养前后定点照片的光密度分析，比较培养前后细胞培养板的透光度，从而反映细胞培养板内骨粉被吸收的程度，以评价破骨细胞的骨吸收功能。

【技术特征摘要】
1.一种评价破骨细胞骨吸收功能的方法，其特征在于，所述的方法是将长径小于30μm的骨粉固定于细胞培养板的底面，通过对培养前后定点照片的光密度分析，比较培养前后细胞培养板的透光度，从而反映细胞培养板内骨粉被吸收的程度，以评价破骨细胞的骨吸收功能。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：a)制板：将长径小于30μm的骨粉进行灭菌，加入酒精溶液制成骨粉混悬液，充分混匀后滴加至细胞培养板的孔中，然后将加好的细胞培养板晾干，再向孔内加入丙酮，所述丙酮的加入量与孔底面积的比例为(10-30)μl:1.75cm2，滴入丙酮后迅速翻转细胞培养板，1-10min之内在孔底做标记，待孔底完全凝固后用蒸馏水冲洗，将未固定在孔底的骨粉冲洗干净，晾干；b)培养前拍照：用显微镜于标记位置拍照，同时选取一个不做任何处理的孔作为校正孔进行拍照，以用于校正培养后拍照时因显微镜参数不一致而产生的误差；c)细胞的接种和培养：在上述细胞培养板内进行细胞的培养，接种浓度为(0.5-1.5)*105个/ml，培养时间为8-14d。d)培养后拍照：培养结束后除去细胞及残留核酸，待细胞培养板晾干后再次对标记位置和校正孔进行拍照；e)照片对比：对培养前后两次照片进行光密度分析，比较细胞培养前后细胞培养板的透光度，从而反映细胞培养板的孔内骨粉被吸收的程度。3.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：漆祎鸣，胡予，任卫英，陆逸，沈志云，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：上海;31