一种检测胶基型烟草制品对人口腔细胞体外微核影响的方法技术

本发明专利技术公开一种检测胶基型烟草制品对人口腔细胞体外微核影响的方法，包括以下步骤：(1)将待测胶基型烟草制品置于液氮中冷冻；(2)将冷冻的胶基型烟草制品立即用粉碎机将其粉碎；(3)再次冷冻；(4)将碎末胶基型烟草制品用人工唾液浸泡；(5)将提取液离心分离；(6)用渗透压测定仪测定上层清液，调节其渗透压与细胞培养基一致；(7)测定提取液中的烟碱含量；(8)培养人口腔黏膜上皮细胞作为检测对象；(9)将提取液加入到培养好的人口腔黏膜上皮细胞中；(10)经过培育后，用高内涵成像仪检测细胞体外微核情况。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物技术应用领域，尤其应用于胶基型烟草制品对于人口腔细胞体外微核影响的测定。
技术介绍
胶基型无烟气烟草制品(Tobacco chewing gum)是一种在胶基中加入了一定量的烟草提取物、香料以及其他一些食用添加剂制成的一种口用无烟气烟草制品。胶基型烟草制品的使用方式是放入口中咀嚼，咀嚼的溶出物会与唾液汇合聚集在口腔中，根据消费习惯的不同吐出或者咽下。由于该产品主要作用于口腔，直接与口腔细胞进行接触，因此有必要建立一种检测其对人口腔细胞体外微核影响的方法，以对其安全性进行评估。现有的烟草制品安全性评价方法主要是针对传统卷烟，通常是对传统卷烟的烟气进行捕集再进行后续的生物学测试。但是胶基型烟草制品并不产生烟气，且直接作用于口腔，因此传统卷烟的安全性评估方法并不适用于该产品。而袋装口含烟制品一般采用贴在牙龈与唇部之间的方式使用，其内含物采用普通浸泡法即可溶出，胶基型烟草制品由于胶基的存在，直接浸泡法大部分内含物难以溶出，从而无法准确进行生物安全性测试。
技术实现思路
本专利技术针对胶基型产品的特点，结合生物学检测方法，建立了一种检测胶基型烟草制品对人口腔细胞体外微核影响的方法，为胶基型烟草制品的安全性评估提供参考。本专利技术公开一种检测胶基型烟草制品对人口腔细胞体外微核影响的方法，包括以下步骤：(1)将待测的所述胶基型烟草制品置于液氮中冷冻20-40min；(2)将步骤(1)冷冻的所述胶基型烟草制品，立即用粉碎机将其粉碎，收集粉碎后的碎末胶基型烟草制品；(3)再次将所述碎末胶基型烟草制品置于液氮中冷冻；(4)将步骤(3)得到的所述碎末胶基型烟草制品用人工唾液浸泡20-40min，每隔2-5min搅动一次；所述人工唾液的温度为36-38℃；(5)将步骤(4)得到的提取液离心分离5-10min；(6)用渗透压测定仪测定步骤(5)得到的上层清液，调节其渗透压与细胞培养基一致，得到胶基型烟草制品提取液；(7)测定提取液中的烟碱含量；(8)培养人口腔黏膜上皮细胞作为检测对象；(9)将步骤(6)中获得的胶基型烟草制品提取液加入到步骤(8)中培养好的人口腔黏膜上皮细胞中；(10)经过不超过于24小时的短期培育后，用高内涵成像仪检测细胞体外微核情况。优选地，步骤(8)中的培养方法包括以下详细步骤：(8-1)口腔黏膜组织的提取：取6岁以下唇腭裂患者的口腔黏膜组织；(8-2)用含青霉素的浓度为100ug/mL、链霉素为50ug/mL的磷酸缓冲液冲洗步骤(8-1)的口腔黏膜组织2-3次；(8-3)组织块的剪切：用眼科剪去除(8-2)中的黏膜下组织，并将修剪后的黏膜剪成约5mm×5mm的小块，然后加入0.25％中性蛋白酶Ⅱ；(8-4)将步骤(8-3)的口腔黏膜小块在4℃下消化16-18h，然后将表层上皮与上皮下层分开；(8-5)上皮细胞的分离：将步骤(8-4)得到的上皮层，加人0.25％胰蛋白酶在36℃下消化15m in，每5m in吹打振动1次，然后加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，吹打成单细胞悬液，离心分离，用磷酸缓冲液冲洗1-2次，然后加入到提前加入了生长因子的角质形成细胞培养基中；(8-6)上皮细胞的原代培养：将步骤(8-5)得到的上皮细胞制成单细胞悬液后用细胞计数，以1-2×105个/mL细胞的密度接种于25cm2培养瓶中，放入37℃，5％CO2培养箱中培养；3d后首次更换培养液，以后每2d更换培养液一次；(8-7)上皮细胞的传代培养：待步骤(8-6)的上皮细胞达到覆盖瓶底的80％时传代培养，用0.25％的胰蛋白酶消化，待上皮细胞变成圆形，用含10％胎牛血 清的DMEM/F12培养基终止消化，离心分离，加入提前加入了生长因子的角质形成细胞培养基，使上皮细胞浓度达到5×104个/mL；将单细胞悬浮液种植到96孔细胞培养板中，接种量为200μL/孔，将种好的96孔细胞培养板放置于37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱内培养24h；优选地，步骤(10)中包括以下详细步骤：(10-1)受试物的孵育：将步骤(6)中获得的胶基型烟草制品提取液加入步骤(8-7)得到的上皮细胞中，以样品烟碱量作为检测剂量划分指标；空白对照组仅加入培养基，溶剂对照组加入人工唾液；将细胞培养板放置于37℃、5％CO2的二氧化碳培养箱内培养24h；(10-2)人口腔黏膜上皮细胞固定：用磷酸缓冲液洗涤步骤(10-1)中的细胞，接着用4％多聚甲醛溶液(临用前配制)固定细胞10min，再用PBS洗涤2次；(10-3)人口腔黏膜上皮细胞膜透化：将步骤(10-2)中的细胞用含0.2％TritonX-100的磷酸缓冲液透化10min，磷酸缓冲液洗涤细胞2次；(10-4)人口腔黏膜上皮细胞核及细胞质染色：用0.1μg/mL FITC染料对步骤(10-3)中的细胞质进行染色20min，再用磷酸缓冲液洗涤96孔板2次；再用含1μg/mL DAPI、100μg/mL RNase A的磷酸缓冲液对细胞核进行染色20min；(10-5)高内涵成像系统检测：选择FITC和DAPI荧光双通道对步骤(10-4)中的细胞进行扫描获取图片；(10-6)图像分析：在图片扫描完成后使用微核分析软件对(10-5)中的图片进行分析，根据细胞核的荧光值与背景荧光值之差设置细胞主核及微核荧光强度参数，测量细胞主核及微核的大小设置核直径参数，根据细胞核之间的距离设置距离参数，根据以上设定对图片进行单核细胞、双核细胞、多核细胞进行分类识别，在结果导出栏选择具有微核的双核细胞数及双核细胞总数，从而计算出微核率；同时将DAPI与FITC通道获取的图片重叠在一张图片上以观察完整的细胞状态，从而对分类识别的结果进行验证。本专利技术有益效果1、本专利技术考虑到胶基型烟草制品难以采用直接浸泡法进行提取的特点，采用超低温(约-196℃)冷冻后粉碎，这可以将胶基这种黏黏糊糊的物质有效粉碎 成粉末，然后将粉末再次用液氮超低温冷冻后，快速加入到常温(36-38℃)人工唾液中，利用从深冷迅速到常温的这种骤热效应，促使粉末因急剧热胀冷缩而进一步破碎，提高粉末与提取液的接触面积，从而提高从粉末中萃取化学物质的效率。2、由于胶基型烟草制品通常为了增强口腔舒适感加入较多的糖分或者盐分等影响液体渗透压的物质，如果直接将提取液加入细胞中易导致由于渗透压的问题而引起细胞死亡，因此本专利技术在处理细胞之前调节了提取液的渗透压，从而提高实验的准确性。3、为了尽量模拟实际情况，本专利技术在提取时采用了人工唾液，并模拟了接近人口腔的温度和食用时间，在检测对象上选择了人口腔细胞，且为了尽量接近人口腔细胞的实际情况，本专利技术采用原代培养的方法培养了正常人口腔黏膜上皮细胞作为检测对象，相比较传统采用动物细胞或者癌细胞的检测，提高了试验的可靠性。4、普通体外微核实验需要大量细胞，由于原代培养细胞的有限性，本实验采用了高内涵成像系统检测体外微核方法，避免了细胞消化离心等步骤的损失，可有效减少细胞数量和操作步骤，提高实验效率。5、一般的体外微核图像分析仅采用单一核染料进行染色，但是由于仅选用单一核染料无法对系统判定的双核进行验证，因此本专利技术增加细胞质染色，从而可对系统分析的双核及微核进行人工验证，提高实验的准确性。具体实施方式1.随机本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测胶基型烟草制品对人口腔细胞体外微核影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将待测的所述胶基型烟草制品置于液氮中冷冻20‑40min；(2)将步骤(1)冷冻的所述胶基型烟草制品，立即用粉碎机将其粉碎，收集粉碎后的碎末胶基型烟草制品；(3)再次将所述碎末胶基型烟草制品置于液氮中冷冻；(4)将步骤(3)得到的所述碎末胶基型烟草制品用人工唾液浸泡20‑40min，每隔2‑5min搅动一次；所述人工唾液的温度为36‑38℃；(5)将步骤(4)得到的提取液离心分离5‑10min；(6)用渗透压测定仪测定步骤(5)得到的上层清液，调节其渗透压与细胞培养基一致，得到胶基型烟草制品提取液；(7)测定提取液中的烟碱含量；(8)培养人口腔黏膜上皮细胞作为检测对象；(9)将步骤(6)中获得的胶基型烟草制品提取液加入到步骤(8)中培养好的人口腔黏膜上皮细胞中；(10)经过不超过于24小时的培育后，用高内涵成像仪检测细胞体外微核情况。

【技术特征摘要】
1.一种检测胶基型烟草制品对人口腔细胞体外微核影响的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将待测的所述胶基型烟草制品置于液氮中冷冻20-40min；(2)将步骤(1)冷冻的所述胶基型烟草制品，立即用粉碎机将其粉碎，收集粉碎后的碎末胶基型烟草制品；(3)再次将所述碎末胶基型烟草制品置于液氮中冷冻；(4)将步骤(3)得到的所述碎末胶基型烟草制品用人工唾液浸泡20-40min，每隔2-5min搅动一次；所述人工唾液的温度为36-38℃；(5)将步骤(4)得到的提取液离心分离5-10min；(6)用渗透压测定仪测定步骤(5)得到的上层清液，调节其渗透压与细胞培养基一致，得到胶基型烟草制品提取液；(7)测定提取液中的烟碱含量；(8)培养人口腔黏膜上皮细胞作为检测对象；(9)将步骤(6)中获得的胶基型烟草制品提取液加入到步骤(8)中培养好的人口腔黏膜上皮细胞中；(10)经过不超过于24小时的培育后，用高内涵成像仪检测细胞体外微核情况。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(8)中的培养方法包括以下步骤：(8-1)口腔黏膜组织的提取：取6岁以下唇腭裂患者的口腔黏膜组织；(8-2)用含青霉素的浓度为100ug/mL、链霉素为50ug/mL的磷酸缓冲液冲洗步骤(8-1)的口腔黏膜组织2-3次；(8-3)组织块的剪切：用眼科剪去除(8-2)中的黏膜下组织，并将修剪后的黏膜剪成约5mm×5mm的小块，然后加入0.25％中性蛋白酶Ⅱ；(8-4)将步骤(8-3)的口腔黏膜小块在4℃下消化16-18h，然后将表层上皮与上皮下层分开；(8-5)上皮细胞的分离：将步骤(8-4)得到的上皮层，加人0.25％胰蛋白酶在36℃下消化15m in，每5m in吹打振动1次，然后加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，吹打成单细胞悬液，离心分离，用磷酸缓冲液冲洗1-2次，然后加入到提前加入了生长因子的角质形成细胞培养基中；(8-6)上皮细胞的原代培养：将步骤(8-5)得到的上皮细胞制成单细胞悬液后用细胞计数，以1-2×105个/mL细胞的密度接种于25cm2培养瓶中，放入37℃，5％CO2培养箱中培养；3d后首次更换培养液，以后每2d更换培养液一次；(8-7)上皮细胞的...

【专利技术属性】
技术研发人员：高茜，夭建华，黄海涛，米其利，李雪梅，倪红梅，唐萍，朱洲海，管莹，
申请(专利权)人：云南中烟工业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南;53