一种用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针试剂盒制造技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种用于检测KIAA1549‑BRAF融合基因的荧光原位杂交探针试剂盒。所述荧光原位杂交探针包含：BRAF基因杂交探针库1，探针的起始位置设计在BRAF基因断裂点左右各50Kb范围内，探针向着丝粒方向延伸，探针的长度为150～300Kb；BRAF基因杂交探针库2，探针的起始位置设计在BRAF基因断裂点左右各50Kb范围内，探针向端粒方向延伸，探针的长度为150～300Kb；两个探针间距离为0～100Kb。本发明专利技术所述杂交探针实现了在同一条染色体上两个距离比较近的融合基因检测，能够在细胞水平上很直观的反应两个基因的融合状态；所述荧光原位杂交探针杂交时间短，具有极高的信噪比、很高的特异性。

A fluorescence in situ hybridization probe kit for detection of KIAA1549-BRAF fusion gene

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针试剂盒
本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针试剂盒。
技术介绍
毛细胞星形细胞瘤(PA)是一种WHO分级为Ⅰ级的颅内原发肿瘤，在儿童神经外科中是最为常见的神经胶质瘤，统计其约占脑部肿瘤的25％。KIAA1549基因和BRAF基因均位于7号染色体q34区域，BRAF基因的串联重复导致了KIAA1549/BRAF基因融合，在毛细胞型星形细胞瘤中高发(60％～80％)。根据KIAA1549及BRAF基因互相融合的位置不同，日前已报道5种不同融合变体，分别为：KIAA1549ex16-BRAFex9，KIAA1549ex15-BRAFex9，andKIAA1549ex16-BRAFex11，KIAA1549ex18-BRAFex10和KIAA1549ex19-BRAFex9；前三种依次占全部变异数目的45％，28％和5％，后两种相对较少。尽管产生上述融合的内在机制目前仍不十分清楚，但不同类型的KIAA1549-BRAF融合突变被认为具有相同的功能。目前为止，对于PA发生发展中的分子机制仍未有非常明确的结论，在PA患者的染色体7q34中检测到异常的基因拷贝，全基因组的高通量测序技术显示丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路异常，该通路的异常与KIAA1549基因和BRAF基因互相融合相关。越来越到的文献报道，KIAA1549:BRAF融合基因已被用作毛细胞星形细胞瘤的诊断标志物。此外2015年度“中国中枢神经系统胶质瘤诊断与治疗指南”中推荐KIAA1549:BRAF融合基因检测作为毛细胞星形细胞瘤的诊断标志物。该融合基因的检测方法目前有4种，全基因组测序(WGS)、转录组测序(RNA-seq)、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和荧光原位杂交(FISH)，由于前两种方法成本高、对样本要求高使其在大多数实验室难以广泛推行；后两种方法也是“中国中枢神经系统胶质瘤诊断与治疗指南”中推荐的检测方法，由于KIAA1549:BRAF基因融合有多种形式，PCR技术检测相对比较困难且无法检测出未报道的融合方式。荧光原位杂交(FISH)技术对于融合基因的检测可以非常直观的反应两种基因的融合状态，对于已报道不同融合类型和未报道的融合方式均可以检出，克服了PCR技术的不足。FISH技术对于KIAA1549:BRAF基因融合的检测应该是首选，但由于两个基因均位于7号染色体q34区域，且染色体位置距离较近，因此常规FISH荧光探针很难检测该融合基因。目前针对该融合基因主要有两种检测探针：BRAF断裂探针和KIAA1549/BRAF融合基因探针。由于已有BRAF断裂探针设计区域分别在BRAF基因断裂区域左右各550Kb范围(图2)，当BRAF基因断裂后，信号点之间距离为1.4Mb区域，该距离比较近，无法区分开断裂信号点；而KIAA1549/BRAF融合基因探针设计区域分别在两个基因发生融合区域，断裂融合后在两个信号点中间多出一个融合信号，但三个信号点间距离约为1.0Mb区域，同样无法区分开断裂信号点。因此，目前常规BRAF断裂探针和KIAA1549/BRAF融合基因探针均不能完全区分阳性和阴性样本。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，目的在于提供一种用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针试剂盒。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针，其特征在于，所述荧光原位杂交探针包含两个探针库，BRAF基因杂交探针库1：探针的起始位置设计在BRAF基因断裂点左右各50Kb范围内，探针向着丝粒方向延伸，探针的长度为150～300Kb；BRAF基因杂交探针库2：探针的起始位置设计在BRAF基因断裂点左右各50Kb范围内，探针向端粒方向延伸，探针的长度为150～300Kb；两个探针库间距离为0～100Kb。上述方案中，BRAF基因杂交探针库1中所述探针的起始位置为BRAF基因11号外显子；BRAF基因杂交探针库2中所述探针的起始位置为BRAF基因9号外显子。上述方案中，所述荧光原位杂交探针的两个探针库标记了两种不同颜色的荧光染料。本专利技术中所述荧光染料选自：CY3、CY5、TAMRA、TexasRed、Rhodamine、FITC、Biotin-aha和FAM。包含上述用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针的试剂盒。用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针的制备方法，包括如下步骤：(1)从UCSCGenomeBrowser下载BRAF基因杂交探针库1和BRAF基因杂交探针库2所覆盖区域的基因组非重复序列，其中BRAF基因杂交探针库1所覆盖区域为：起始位置在BRAF基因断裂点左右各50Kb范围内，探针向着丝粒方向延伸，探针的长度为150～300Kb，BRAF基因杂交探针库2所覆盖区域为：起始位置在BRAF基因断裂点左右各50Kb范围内，向端粒方向延伸长度为150～300Kb；两个探针库间距离为0～100Kb。(2)将步骤(1)获得的BRAF基因杂交探针库1所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray软件进行探针设计、探针筛选，筛选出的探针导出到EXCEL表格中，得到一系列BRAF基因探针序列1；(3)将步骤(1)获得的BRAF基因杂交探针库2所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray软件进行探针设计、探针筛选，筛选出的探针导出到EXCEL表格中，得到一系列BRAF基因探针序列2；(4)使用DNA合成仪对步骤(2)所得一系列BRAF基因探针序列1进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到BRAF基因杂交探针库1；同理，使用DNA合成仪对步骤(3)所得一系列BRAF基因探针序列2进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到BRAF基因杂交探针库2；(5)使用带有不同荧光基团的通用引物分别对BRAF基因杂交探针库1和BRAF基因杂交探针库2进行扩增标记反应，得到荧光标记的BRAF基因杂交探针库1和BRAF基因杂交探针库2，所述荧光标记的BRAF基因杂交探针库1和BRAF基因杂交探针库2构成了用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针。上述方案中，步骤(2)和步骤(3)中所述探针筛选的条件为：探针长度50bp，TM值85～99℃，GC比40～80％，不含TTTT/GGGG/AAAA/CCCC，探针最小间隔5bp。上述方案中，在步骤(2)所得一系列BRAF基因探针序列1的每条探针5’端和3’端加上18bp的标签序列；在步骤(3)所得一系列BRAF基因探针序列2的每条探针5’端和3’端加上18bp的标签序列；所述标签序列的碱基序列如下所示：5’端标签序列为：TGTAAAACGACGGCCAG；3’端标签序列为：GGTCATAGCTGTTTCCTG。上述方案中，所述通用引物的序列如下所示：M13-FTGT本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测KIAA1549‑BRAF融合基因的荧光原位杂交探针，其特征在于，所述荧光原位杂交探针包含两个探针库，BRAF基因杂交探针库1：探针的起始位置设计在BRAF基因断裂点左右各50Kb范围内，探针向着丝粒方向延伸，探针的长度为150~300Kb；BRAF基因杂交探针库2：探针的起始位置设计在BRAF基因断裂点左右各50Kb范围内，探针向端粒方向延伸，探针的长度为150~300Kb；两个探针库间距离为0~100Kb。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针，其特征在于，所述荧光原位杂交探针包含两个探针库，BRAF基因杂交探针库1：探针的起始位置设计在BRAF基因断裂点左右各50Kb范围内，探针向着丝粒方向延伸，探针的长度为150~300Kb；BRAF基因杂交探针库2：探针的起始位置设计在BRAF基因断裂点左右各50Kb范围内，探针向端粒方向延伸，探针的长度为150~300Kb；两个探针库间距离为0~100Kb。2.根据权利要求1所述的用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针，其特征在于，BRAF基因杂交探针库1中所述探针的起始位置为BRAF基因11号外显子；BRAF基因杂交探针库2中所述探针的起始位置为BRAF基因9号外显子。3.根据权利要求1所述的用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针，其特征在于，所述荧光原位杂交探针的两个探针库标记了两种不同颜色的荧光染料。4.包含权利要求1~3任一所述用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针的试剂盒。5.权利要求1~3任一所述用于检测KIAA1549-BRAF融合基因的荧光原位杂交探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）从UCSCGenomeBrowser下载BRAF基因探针库1和BRAF基因探针库2所覆盖区域的基因组非重复序列，其中BRAF基因杂交探针库1所覆盖区域为：起始位置在BRAF基因断裂点左右各50Kb范围内，探针向着丝粒方向延伸，探针的长度为150~300Kb，BRAF基因杂交探针库2所覆盖区域为：起始位置在BRAF基因断裂点左右各50Kb范围内，向端粒方向延伸长度为150~300Kb；两个探针库间距离为0~100Kb；（2）将步骤（1）获得的BRAF基因杂交探针库1所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray软件进行探针设计、探针筛选，筛选出的探针导出到EXCEL表格中，得到一系列BRAF基因探针序列1；（3）将步骤（1）获得的BRAF基因杂交探针库2所覆盖区域的基因组非重复序列使用perl插件程序chunks.pl分割成1kb大小的区块；将分割后的区块批量导入OligoArray软件进行探针设计、探针筛选，筛选出的探针导出到EXCEL表格中，得到一系列BRAF基因探针序列2；（4）使用DNA合成仪对步骤（2）所得一系列BRAF基因探针序列1进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到BRAF基因杂交探针库1；同理，使用DNA合成仪对步骤（3）所得一系列BRAF基因探针序列2进行化学合成，将化学合成的探针进行混合，制备得到BRAF基因杂交探针库2；（5）使用带有...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕玉琦，李先洋，李倩，李雪梅，叶伦，程弘夏，陈刚，
申请(专利权)人：武汉康录生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42