【技术实现步骤摘要】
本申请涉及分子生物学领域，具体涉及一种检测apl多种不同形式融合基因的探针及其应用。
技术介绍
1、急性早幼粒细胞白血病(apl)是一种罕见的血液系统恶性肿瘤，其特点是骨髓中早幼粒细胞异常增生，并且通常伴随有出血倾向。apl的发病率较低，约占所有白血病的5%左右，但该病的预后较差，如果不及时治疗，患者的生存率很低。apl的发病机制与pml-rara融合基因密切相关。pml-rara融合基因是由15号染色体上的pml基因和17号染色体上的rara基因相互融合而成的。这种融合基因编码出一种具有异常转录活性的蛋白质，可以干扰正常的造血细胞分化和增殖，导致急性早幼粒细胞白血病的发生。
2、apl分为典型性apl和非典型性apl，典型性apl的融合基因为t(15；17)(q22；q21)，非典型性apl又分为隐匿性遗传学异常和变异型apl。隐匿性遗传学异常中的一种为插入融合，插入融合通常位于15号染色体上，即rarα基因插入pml基因区域。插入融合通常仅是rara上的小片段插入pml基因，这种小片段在现有检测方法中由于荧光信号较弱，易被背景噪音干扰等原因而不容易检测。变异型apl包括rara基因与其他基因发生融合，如zbtb16、stat5b、tnrc18、irf2bp2等。隐匿性遗传学异常和变异型apl的不同种类的融合基因中并非所有的对atra或ato治疗有效。因此区分不同形式的基因融合具有临床学上的意义。
3、一般情况下，pml/rara发生融合时会形成pml/rara和rara/pml两种融合，荧光原位杂交检
4、现有荧光原位杂交技术主要设计为pml和rara的双色融合探针，发生融合时并不能区分是pml/rara或rara/pml融合，发生rara基因与其它伙伴基因融合时仅表现为单色信号增多，但单色信号增多也可能来源于染色体多体或对应基因区域扩增；目前常用的探针主要是通过对特定人类基因组bac克隆进行缺口平移法或随机引物法标记，此方法包含重复序列，经过封闭后仍有较高的杂交背景，且pml探针区域存在非特异性序列，因此，部分隐匿融合（如小片段的插入形成的融合）无法检出。
5、本方案一方面将rara基因不同区域设计为不同荧光的探针，在发生融合的时候能区分是pml/rara或是rara/pml融合；另一方面，由于rara基因区域单独设计探针，方便检出rara基因插入pml基因形成的隐匿融合，若发生rara基因与其它基因融合也可更好的给予提示。
6、另外，本方案采用非重复序列探针，一方面去除了pml探针区域中的非特异性序列，提高了pml探针的特异性；另一方面去除了基因组中含有的重复序列，减少了探针与检测标本的非特异性杂交，降低了荧光杂交背景，有利于发现细微的信号改变，增加隐匿融合检出的可能性，提高了探针检测的特异性、灵敏度和准确率。
技术实现思路
1、为了解决上述至少一种技术问题，开发一种检测apl多种不同形式的融合基因的探针及其应用。
2、本专利技术第一方面提供一种用于诊断apl融合基因的探针组合物，所述组合物包括pml探针和rara探针，所述pml探针覆盖区域为：pml基因及其上游、下游连续约680kb的基因区域，所述rara探针覆盖区域为：rara基因及其上游、下游连续约750kb的基因区域，所述rara探针分为3个区域，分别为第一区域，第二区域和第三区域，所述pml探针、rara探针的第一区域、第二区域和第三区域分别使用不同的颜色进行标记。
3、采用本申请的技术方案，通过将rara探针进行分色处理，可以根据融合信号的颜色区分是典型性apl和非典型性apl，而使用传统的双色双融合探针对于对于非典型性apl尤其是非典型性apl具体基因突变型区分存在较大难度或者无法区分。由于不同的基因型对于临床治疗或者用药效果存在区别，因此区分非典型性apl的具体基因突变型具有临床指导意义。
4、在本申请的优选方案中，所述pml探针覆盖区域是指包含pml基因起始位点上游约300kb-约350kb的上游区域、pml基因区域和pml基因结束位点下游约300kb-约350kb的下游区域。
5、在本申请的优选方案中，所述pml基因区域是指chr15:73994716-74047827。
6、在本申请的优选方案中，所述pml基因上游区域选自pml基因起始位点上游约300kb~约310kb、约310kb~约320kb、约320kb~约330kb、约330kb~约340kb或约340kb~约350kb的区域。
7、在本申请的优选方案中，所述pml基因上游区域选自pml基因起始位点上游约310kb~约315kb或约315kb~约320kb的区域。
8、在本申请的优选方案中，所述pml基因上游区域选自pml基因起始位点上游310kb、311kb、312kb、313kb、314kb、315kb、316kb、317kb、318kb、319kb或320kb的区域。
9、在本申请的优选方案中，所述pml基因下游区域选自pml基因起始位点下游约300kb~约310kb、约310kb~约320kb、约320kb~约330kb、约330kb~约340kb或约340kb~约350kb的区域。
10、在本申请的优选方案中，所述pml基因下游区域选自pml基因结束位点下游约310kb~约315kb或约315~约320kb的区域。
11、在本申请的优选方案中，所述pml基因下游区域选自pml基因结束位点下游310kb、311kb、312kb、313kb、314kb、315kb、316kb、317kb、318kb、319kb或320kb的区域。
12、pml基因长度约53kb，如果探针仅覆盖基因区域则会由于长度偏小，荧光较弱等问题加大结果分析的难度，因此通常探针覆盖区域会增加到基因的上游区域和下游区域，以加大荧光标记的区域增强荧光信号。探针覆盖的上下游区域长度基本相同，使得覆盖pml基因的区域正好处于中间位置，这样能够使得pml基因发生断裂后，分成的两个部分荧光信号强度相当且均易于识别。
13、在本申请的优选方案中，所述rara探针的第一区域包含rara基因起始位点上游约320kb-约380kb的上游区域，所述rara探针的第二区域包含rara基因区域，所述rara探针的第三区域包含rara基因结束位点下游约320kb-约380kb的下游区域。
14、在本申请的优选方案中，所述rara探针的第二区域包含rara基因区域，所述rara基因区域为chr17:40309180-40357643。
15、在本申请的优选方案中，所述rara探针的第一区域包含rara基因起始位点上游约320kb-约3本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于诊断APL融合基因的探针组合物，其特征在于，包括PML探针和RARA探针，所述PML探针覆盖区域为：PML基因及其上游、下游连续约680kb的基因区域，所述RARA探针覆盖区域为：RARA基因及其上游、下游连续约750kb的基因区域，所述RARA探针分为3个区域，分别为第一区域，第二区域和第三区域，所述PML探针、RARA探针的第一区域、第二区域和第三区域分别使用不同的颜色进行标记。
2.根据权利要求1所述的探针组合物，其特征在于，所述PML探针覆盖区域是指包含PML基因起始位点上游约300kb-约350kb的上游区域、PML基因区域和PML基因结束位点下游约300kb-约350kb的下游区域。
3.根据权利要求1所述的探针组合物，其特征在于，所述RARA探针的第一区域包含RARA基因起始位点上游约320kb-约380kb的上游区域，所述RARA探针的第二区域包含RARA基因区域，所述RARA探针的第三区域包含RARA基因结束位点下游约320kb-约380kb的下游区域。
4.根据权利要求1所述的探针组合物，其特征在于，所述PML探
5.根据权利要求1所述的探针组合物，其特征在于，所述PML探针使用青色荧光基团标记、RARA探针的第一区域使用黄色荧光基团标记，RARA探针的第二区域使用红色荧光基团标记，RARA探针的第三区域使用绿色荧光基团标记。
6.一种权利要求1-5任意一项所述的探针组合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤，
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，其中步骤（2）中所述17bp的标签序列为TGTAAAACGACGGCCAG，所述18bp的标签序列为GGTCATAGCTGTTTCCTG。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，其中步骤（2）中所述探针筛选条件为探针长度50-150 bp，TM值85~99℃，GC比40~80%，不含TTTT/GGGG/AAAA/CCCC，探针间最小间隔5 bp。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，其中所述PML基因探针使用青色荧光基团标记，RARA探针的第一区域探针使用黄色荧光基团标记，RARA探针的第二区域探针使用红色荧光基团标记，RARA探针的第三区域探针使用绿色荧光基团标记。
10.一种用于诊断APL融合基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含，
...【技术特征摘要】
1.一种用于诊断apl融合基因的探针组合物，其特征在于，包括pml探针和rara探针，所述pml探针覆盖区域为：pml基因及其上游、下游连续约680kb的基因区域，所述rara探针覆盖区域为：rara基因及其上游、下游连续约750kb的基因区域，所述rara探针分为3个区域，分别为第一区域，第二区域和第三区域，所述pml探针、rara探针的第一区域、第二区域和第三区域分别使用不同的颜色进行标记。
2.根据权利要求1所述的探针组合物，其特征在于，所述pml探针覆盖区域是指包含pml基因起始位点上游约300kb-约350kb的上游区域、pml基因区域和pml基因结束位点下游约300kb-约350kb的下游区域。
3.根据权利要求1所述的探针组合物，其特征在于，所述rara探针的第一区域包含rara基因起始位点上游约320kb-约380kb的上游区域，所述rara探针的第二区域包含rara基因区域，所述rara探针的第三区域包含rara基因结束位点下游约320kb-约380kb的下游区域。
4.根据权利要求1所述的探针组合物，其特征在于，所述pml探针、rara探针的第一区域、rara探针的第二区域和rara探针的第三区域中的探针长度为50-150bp。...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈刚，李倩，程宏夏，李雪梅，方磊，胡晓晨，曹浩飞，余惠子，
申请(专利权)人：武汉康录生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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