【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于肿瘤分子生物学领域，具体地说，基于pandora-seq测序技术筛选一组与胃癌早期诊断相关的血浆外泌体cfrna标志物组合及其应用。
技术介绍
1、胃癌是全球第五大癌症，也是癌症死亡的第三大原因。在中国，男性发病率为29.5/10万，女性发病率12.3/10万，总体死亡率为15.9/10万。最新数据指出，全球每年新发胃癌病例约为120万，中国约占其中40%以上。我国早期胃癌占比较低，仅约20%，大多数为胃癌中晚期，患者5年生存率低于30%。
2、影像学检查、血清学筛查和内镜筛查是目前临床上常用的胃癌诊断方法，但这些筛查手段具有一定局限性，超声、ct、mri、x 线气钡双重对比造影、pet-ct等影像学方法仅作为常规辅助手段对中晚期肿瘤分期诊断、转移病灶数目及部位进行初步检测，其在早期胃癌筛查和诊断中应用受限。常规血清pg、g-17、hp检查对于判断胃部病变部位准确性低，且其灵敏性和特异性较差。血清肿瘤标志物如：癌胚抗原cea、ca72-4、ca19-9、，ca125、ca242等在进展期胃癌中的阳性率仅为20%~30%，在早期胃癌中的阳性率低于10%，对于早期胃癌筛査价值有限，不建议作为胃癌筛查的方法。内镜及内镜下活检是目前诊断胃癌的金标准，但其操作繁琐，价格昂贵，同时患者体验不佳，普遍接受度低。因此,筛选敏感有效的生物标志物，在早期对胃癌进行诊断,对提高胃癌的治疗和预后具有重要意义。
3、cfrna (circulating-free rna)也称细胞外rna(cell-free rna)
4、rna高通量测序（rna-seq）是目前高通量测序技术中应用最为广泛的一种技术，促进了小分子非编码rna(sncrnas)的发现。但由于sncrna深度测序的互补 dna(cdna) 文库的传统构建是基于与3'和5'小rna的接头连接进行反转录，仅对许多具有5'磷酸(5'-p)和3'羟基(3'-oh)的小rna检测有效，例如microrna (mirna)。当sncrna带有特定rna修饰时，干扰接头连接和逆转录过程，因此，传统的测序技术应用受限，测序结果也会产生一定的偏差。rna修饰包括3'末端修饰，例如3'-磷酸(3'-p)和2，3'-环磷酸 (2，3'-cp)会阻断接头连接过程；同样地，rna甲基化，例如m1a、m3c、m1g和m22g会干扰逆转录过程。因此，带有一种或多种这种修饰的sncrna通常低效和不完全地转化为 cdna，从而使深度测序对其检测和定量具有一定挑战性，尤其是对于具有高度修饰的sncrnas（trna衍生的小rna(tsrna)、rrna衍生的小rna(rsrna)）来说更为严重。为了解决传统 rna-seq对高度修饰的sncrnas检测和定量受限问题，技术人员开发了酶处理方案来解决特定的rna修饰问题，例如：t4多核苷酸激酶（t4pnk）用于将3'-p或2'3/-cp转化为3'-oh，并添加5'-末端磷酸盐（5'-p），从而促进小rna和大rna的接头连接；脱烷基酶α-酮戊二酸依赖性羟化酶(alkb)及其突变体形式处理高度修饰的sncrna，可以使rna修饰（例如：m1g、m1a、m3c和m22g）去甲基化，从而实现逆转录。值得注意的是，这些处理方式单独使用时都无法捕获超出其酶促能力修饰的sncrna，因此无法揭示完整的sncrna谱。
5、基于以上问题，本专利技术提出了一种新的sncrna测序技术—pandora-seq。pandora-seq是基于t4pnk和alkb组合酶对小rna片段（15-50个核苷酸）进行连续酶处理，去除阻碍接头连接和逆转录过程的关键rna修饰，更广泛、更准确地呈现包括了小鼠和人体组织和细胞中先前从未识别且具有高度修饰的 sncrna图谱。令人惊讶的是，传统rna-seq检测到的sncrna主要是mirna，pandora-seq揭示了样本中除mirna外还富含tsrna和rsrna，更大程度上提高了大多数tsrna和rsrna亚类的相对水平，为临床研究提供更可靠的技术支持。因此，基于pandora-seq测序技术筛选胃癌中异常表达且具有高敏感性和高特异性的血浆外泌体cfrna作为分子生物标志物，并研发相关胃癌诊断产品，对于胃癌早期筛查诊断和预后治疗效果的监测十分重要。
技术实现思路
1、本专利技术的首要目的是通过pandora-seq技术筛选一组血浆外泌体cfrna生物标志物，其异常表达提示与胃癌的发生发展相关。
2、本专利技术的第二个目的是提供上述标志物的茎环引物、正向引物和通用反向引物。
3、本专利技术的第三个目的是提供上述标志物及其引物（茎环引物、正向引物和通用反向引物）在用于制备诊断胃癌产品的应用，该产品包括试剂、试剂盒或基因芯片。
4、为实现上述目的,本专利技术将采用以下技术方案:
5、本专利技术通过pandora-seq测序技术，使用t4pnk和alkb组合酶对小rna片段（15-50个核苷酸）进行连续酶处理，去除阻碍接头连接和逆转录过程的关键 rna 修饰，通过对健康对照者与胃癌患者血浆外泌体总rna进行处理测序，分析并筛选在胃癌患者血浆外泌体差异表达的cfrna分子生物标志物。
6、结合pandora-seq测序结果，本专利技术提供了一组与胃癌诊断相关的血浆外泌体cfrna标志物，选自如下cfrna标志物中的一种或几种:
7、cggccgatcgaaagggagt,28s-rrna：序列如seq id no.1所示；
8、hsa-mir-7847-3p：序列如seq id no.2所示；
9、tsrna-5023a-leucaa/leucag：序列如seq id no.3所示。
10、结合pandora-seq测序结果，本专利技术提供了上述3种血浆外泌体cfrna标志物的茎环引物，茎环引物的序列为:
11、cggccgatcgaaagggagt,28s-rrna的茎环引物为：seq id no.4；
12、hsa-mir-7847-3p的茎环引物为：seq id no.5；
13、tsrna-5023a-leucaa/leucag的茎环引物为：s本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一组与胃癌早期诊断相关的血浆外泌体cfRNA标志物，其特征在于：选自如下cfRNA标志物的一种或几种：
2.检测权利要求1中cfRNA标志物的产品在用于制备诊断胃癌产品的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的产品为试剂、试剂盒或基因芯片。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的试剂盒中包括用于分离血浆外泌体的试剂和qRT-PCR试剂。
5.一组与胃癌诊断相关的血浆外泌体cfRNA引物，其特征在于：选自如下茎环引物中的一种或几种：
6.权利要求5所述的cfRNA引物在制备用于诊断胃癌产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的胃癌诊断产品，其特征在于：所述的产品为试剂、试剂盒或基因芯片。
8.一组与胃癌诊断相关的血浆外泌体cfRNA引物，其特征在于：选自如下引物组中的一种或几种：
9.权利要求8所述的cfRNA引物在制备用于诊断胃癌产品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的产品为试剂、试剂盒或基因芯片。
【技术特征摘要】
1.一组与胃癌早期诊断相关的血浆外泌体cfrna标志物，其特征在于：选自如下cfrna标志物的一种或几种：
2.检测权利要求1中cfrna标志物的产品在用于制备诊断胃癌产品的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的产品为试剂、试剂盒或基因芯片。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的试剂盒中包括用于分离血浆外泌体的试剂和qrt-pcr试剂。
5.一组与胃癌诊断相关的血浆外泌体cfrna引物，其特征在于：选自如...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。