由体细胞突变基因编码的HLA限制性表位制造技术

由癌基因编码的突变表位几乎一直位于细胞内部，使它们对常规抗体来说是不可见的。发明专利技术人产生了对由人白细胞抗原(HLA)分子在细胞表面呈递的突变肽特异的单链可变区片段(scFv)。这些scFv可被转化为全长抗体，称为MANAbody，靶向与HLA结合的“突变相关的新抗原”。表示单链可变区片段序列的高度多样性排列的噬菌体展示文库被首先设计和构建。然后使用竞争选择方法以鉴定对与预先限定的HLA类型结合的肽特异的克隆。以这种方式，发明专利技术人获得了scFv，包括对由常见KRAS突变体编码的肽特异的一个和对由常见EGFR突变体编码的肽特异的另一个。可以开发靶向MANA的分子，其甚至在这些肽与正常的野生型形式仅一个氨基酸不同时，与突变肽‑HLA复合物特异性反应。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】由体细胞突变基因编码的HLA限制性表位本专利技术是在国立卫生研究院授予的CA43460和CA062924下由政府支持完成的。政府在本专利技术中具有一定权利。
本专利技术涉及抗体产生领域。具体地，其涉及在单链或其他类型的抗体分子中含有抗体可变区的构建物。
技术介绍
癌症是癌基因和肿瘤抑制基因相继突变的结果(1)。理论上，体细胞突变是理想的治疗靶点，因为它们几乎未见于任何正常细胞(2)。即使这些突变的蛋白质产物通常仅略微不同于野生型(wt)形式，经常在于单个氨基酸，但这种不同对于有效的靶向是足够的。当蛋白质为酶，例如由BRAF编码的酶时，产生的结构改变可以提供用于结合具体的酶抑制剂的袋(3-5)。抗体是现代药剂最成功的类型之一，并已被显示能够特异性识别不同仅在于单个氨基酸或仅在于单个氨基酸的修饰的蛋白质(5-11)。但是，用于临床的所有抗体直接针对细胞表面或分泌的蛋白质而不是细胞内蛋白质。细胞内蛋白质不能接近大的分子例如抗体，但是不幸地，由突变基因编码的绝大多数异常表位不在细胞表面上(2)。细胞内抗原，例如病毒组分，可以被免疫系统识别，但是这种识别是基于与细胞表面的人白细胞抗原(HLA)分子复合的蛋白水解加工的肽的识别(12)。实际上，癌症中10％至20％的由突变基因产生的表位(下文称为MANA，突变相关的新抗原)被预测结合常见的HLA型(12)。此外，可以结合这种肽-HLA复合物的T细胞的实例已经见于患者以及实验动物(13-16)。体内产生的针对MANA的大多数T细胞应答是“专用的(私人的，private)”，即直接针对由存在于个别患者或小鼠的癌症中但不常见于患者且不驱动瘤生长的偶发突变(伴随突变，passengermutations)编码的突变表位(2)。靶向这种抗原的免疫剂仅用于具有特定MANA的个别患者的治疗(16-20)。本领域持续地需要鉴定用于包括但不限于癌症的疾病的新的治疗剂、诊断剂和分析剂。
技术实现思路
根据本专利技术的一个方面，提供了包括抗体可变区的分离的分子。抗体可变区特异性结合人白细胞抗原(HLA)分子、β-2-微球蛋白分子和作为蛋白质的部分的肽的复合物。肽包括在蛋白质的细胞内表位中的突变残基。当HLA分子不在复合物中时，分子不特异性结合HLA分子。分子也不特异性结合野生型形式的肽。任选地，当不存在于HLA复合物内时分子不特异性结合肽。分离的分子可以用于检测或监测癌细胞或用于治疗癌症。根据本专利技术的另一个方面，提供了用于从核酸文库中选择scFv或Fab或TCR的方法，所述scFv或Fab或TCR特异性结合(a)人白细胞抗原(HLA)分子、(b)β-2-微球蛋白分子和(c)蛋白质肽部分的第一形式的复合物。第一形式包括突变残基，并且突变残基在蛋白质的细胞内表位中。当HLA分子不在复合物中时，scFv或Fab或TCR不特异性结合HLA分子。scFv或Fab或TCR不特异性结合处于其野生型形式的肽。方法包括如下步骤：在包括(a)结合(b)HLA和(c)β-2-微球蛋白的肽部分的第二形式的竞争复合物的存在下阳性地选择结合所述复合物的scFv或Fab或TCR。第二形式选自野生型形式和具有与第一形式不同的突变残基的肽。在任选的步骤的连续执行过程中，复合物和竞争复合物的量可被改变以便竞争复合物与相关复合物的比例增加。根据本专利技术的另一个方面，提供了用于从核酸文库中选择特异性结合蛋白质的肽部分的第一形式的scFv或Fab或T细胞受体。第一形式包括突变残基，其在蛋白质的细胞内表位中。scFv或Fab或TCR不特异性结合处于其野生型形式的肽。方法包括如下步骤：在肽部分的竞争物第二形式的存在下阳性地选择结合第一形式的scFv或Fab或T细胞受体，其中第二形式选自野生型形式和具有与第一形式不同的突变残基的肽。本领域技术人员在阅读说明书后将会明白的这些和其他实施方式为本领域提供了用于接近(accessing)通常在细胞内但在疾病状况中展示在特定细胞表面上的表位的剂。附图说明图1.MANAbody的产生。利用在中心突出显示的竞争性噬菌体选择概述MANAbody产生的方法。图2A-2E.噬菌体和纯化的scFv与突变单体的选择性结合。将用指示的肽、β-2-微球蛋白和HLA分子折叠的单体与不同稀释度的噬菌体克隆或纯化的scFv温育，然后用抗-M13(对于噬菌体)或抗-Flag标签(对于scFv)抗体进行ELISA。(图2A)在最后选择阶段后收集和扩增的噬菌体克隆对于KRAS(G12V)-HLA-A2结合物(binder)的选择性结合。克隆D10通过红色箭头突出显示。(图2B)噬菌体克隆D10与不同单体的选择性结合。在1:80稀释度时，KRAS(G12V)-HLA-A2与每种其它单体相比，****，P<0.0001。(图2C)纯化的D10scFv与不同单体的选择性结合。在1μg/mL稀释度时，KRAS(G12V)-HLA-A2与每种其它单体相比，****，P<0.0001。(图2D)噬菌体克隆C9与不同单体的选择性结合。在1:900稀释度时，EGFR(L858R)-HLA-A3与每种其它单体相比，****，P<0.0001。(图2E)纯化的C9scFv与不同单体的选择性结合。在1μg/mL稀释度时，EGFR(L858R)-HLA-A3与每种其它单体相比，****，P<0.0001。(B-E)，用野生型或指定的突变肽和HLA分子折叠的单体在x轴示出。ELA：阴性对照肽，无单体(NoMonomer)：孔用链霉亲和素包被而没有单体结合。图3A-3D.候选噬菌体克隆或纯化的D10scFv与在细胞表面展示突变肽的细胞的选择性结合。T2或T2A3细胞用指示的肽脉冲(pulsed)，然后与D10噬菌体(图3A)、纯化的D10scFv(图3B)或C9噬菌体(图3C)温育，然后通过流式细胞术分析染色的细胞。ELA，LLG：阴性对照；对于C9噬菌体，KRAS(野生型)被用作阴性对照肽。(图3D)，scFv介导的补体依赖的细胞杀伤。在T2细胞被用指示的肽脉冲或未脉冲或脉冲后，通过将T2细胞与10％兔补体和预缀合至抗-V5抗体的D10scFv或D10-7scFv温育来执行CDC试验。CellTiter-被用于评估细胞的生存能力。在0.66nM(在x轴上-0.18)抗体浓度时，KRAS(G12V)/D10-7与所有其它点相比，***P<0.001。在0.66nM抗体浓度时，KRAS(WT)/D10-7与未脉冲的/D10-7相比，ns，不显著(P＝0.488)。图4A-4B.D10MANAbody的选择性亲和力。(图4A)D10MANAbody与KRAS(G12V)-HLA-A2的选择性结合。将用指示的肽和HLA分子折叠的单体与不同稀释度的D10MANAbody温育，然后用抗-人IgG抗体进行ELISA。在1μg/mL稀释度时，KRASG12VHLA-A2与每种其它单体相比，***，P<0.0001。(图4B)D10MANAbody与在细胞表面展示突变肽的细胞的选择性结合。T2细胞未脉冲或被用指示的肽脉冲，然后与D10MANAbody或与同种型对照抗体温育，然后通过流式细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
包括抗体可变区的分离的分子，所述抗体可变区特异性结合人白细胞抗原(HLA)分子和作为蛋白质的部分的肽的复合物，其中所述肽包括突变残基，并且其中所述突变残基在所述蛋白质的细胞内表位中，其中当所述HLA分子不在所述复合物中时，所述分子不特异性结合所述HLA分子，和其中所述分子不特异性结合处于其野生型形式的所述肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.23 US 62/136,843;2015.06.30 US 62/186,4551.包括抗体可变区的分离的分子，所述抗体可变区特异性结合人白细胞抗原(HLA)分子和作为蛋白质的部分的肽的复合物，其中所述肽包括突变残基，并且其中所述突变残基在所述蛋白质的细胞内表位中，其中当所述HLA分子不在所述复合物中时，所述分子不特异性结合所述HLA分子，和其中所述分子不特异性结合处于其野生型形式的所述肽。2.权利要求1所述的分离的分子，其中所述复合物还包括β-2-微球蛋白分子。3.权利要求1所述的包括抗体可变区的分离的分子，其为scFv。4.权利要求1所述的包括抗体可变区的分离的分子，其为Fab。5.权利要求1所述的包括抗体可变区的分离的分子，其中所述蛋白质为致癌蛋白质。6.权利要求5所述的包括抗体可变区的分离的分子，其中所述致癌蛋白质为表皮生长因子受体(EGFR)。7.权利要求6所述的包括抗体可变区的分离的分子，其中所述致癌蛋白质具有L858R突变。8.权利要求6所述的包括抗体可变区的分离的分子，其中所述致癌蛋白质具有T790M突变。9.权利要求5所述的包括抗体可变区的分离的分子，其中所述致癌蛋白质为ABL。10.权利要求5所述的包括抗体可变区的分离的分子，其中所述致癌蛋白质为bcr/ABL融合蛋白。11.权利要求9所述的包括抗体可变区的分离的分子，其中所述致癌蛋白质具有E225K突变。12.权利要求5所述的包括抗体可变区的分离的分子，其中所述致癌蛋白质为β-联蛋白。13.权利要求12所述的包括抗体可变区的分离的分子，其中所述致癌蛋白质具有S45F突变。14.权利要求5所述的包括抗体可变区的分离的分子，其中所述致癌蛋白质为P53。15.权利要求14所述的包括抗体可变区的分离的分子，其中所述致癌蛋白质具有R248W突变。16.权利要求14所述的包括抗体可变区的分离的分子，其中所述致癌蛋白质具有R248Q突变。17.权利要求5所述的包括抗体可变区的分离的分子，其中所述致癌蛋白质为KRAS。18.权利要求17所述的包括抗体可变区的分离的分子，其中所述致癌蛋白质具有G12突变。19.权利要求17所述的包括抗体可变区的分离的分子，其中所述致癌蛋白质具有G12V突变。20.权利要求17所述的包括抗体可变区的分离的分子，其中所述致癌蛋白质具有G12C突变。21.权利要求17所述的包括抗体可变区的分离的分子，其中所述致癌蛋白质具有G12D突变。22.权利要求1所述的包括抗体可变区的分离的分子，其中所述蛋白质为肿瘤抑制物(suppressor)。23.权利要求1所述的包括抗体可变区的分离的分子，当其不在所述复合物中时，其不结合所述肽。24.权利要求2所述的包括抗体可变区的分离的分子，其中所述HLA分子为HLA-A2。25.权利要求2所述的包括抗体可变区的分离的分子，其中所述HLA分子为HLA-A3。26.权利要求1所述的包括抗体可变区的分离的分子，其与可检测标记结合。27.权利要求1所述的包括抗体可变区的分离的分子，其与治疗剂结合。28.权利要求1所述的包括抗体可变区的分离的分子，其作为嵌合蛋白质的部分被表达，所述嵌合蛋白质包括跨膜区和细胞内结构域，以形成嵌合抗原受体(CAR)。29.权利要求1所述的包括抗体可变区的分离的分子，其作为嵌合蛋白质的部分被表达，所述嵌合蛋白质包括与CD3特异性结合的scFv。30.从核酸文库中选择特异性结合人白细胞抗原(HLA)分子和蛋白质的肽部分的第一形式的复合物的scFv或Fab或T细胞受体的方法，其中所述第一形式包括突变残基，并且其中所述突变残基在所述蛋白质的细胞内表位中，其中当所述HLA分子不在所述复合物中时所述scFv或Fab或T细胞受体不特异性结合...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·沃格尔斯坦，K·W·肯斯勒，S·周，L·迪亚斯，N·帕帕佐普洛斯，A·斯科拉，J·多格拉斯，M·S·赫望，
申请(专利权)人：约翰·霍普金斯大学，
类型：发明
国别省市：美国,US