本发明专利技术提供免疫原性降低的杂交抗体及其抗体结合片段及其制备方法。所述方法包括将已经进行体细胞超突变的杂交抗体或其抗原结合片段的至少一个供体构架区内的一个或多个氨基酸残基用种系构架序列相应位置的氨基酸残基置换。本发明专利技术还提供杂交抗体或其抗原结合片段，其含有来源于同一种系基因家族或种系基因家族成员的至少两个供体构架区且其中构架区内的至少一个氨基酸残基被种系构架区相应位置的氨基酸残基置换。杂交抗体或其抗原结合片段可含有人构架区和非人ＣＤＲ。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请本申请要求2008年11月6日申请的美国临时申请号61/198，466的权益，所述申请通过引用其整体结合到本文中。
技术介绍
抗体是脊椎动物在响应抗原刺激时由称为B细胞的淋巴细胞产生的蛋白质。抗体 (亦称免疫球蛋白(Ig))分子的基本结构单元由4条结合在一起的多肽链组成，呈大写字母“Y”形状。4条链中的2条是相同的轻(L)链，2条是相同的重(H)链。有5种不同类型 (同种型)的重链，将抗体分成5个类别，即IgA、IgD, IgE, IgG和IgM0另外，有两种不同的轻链同种型，称为κ和λ。每个类型的重链可与任一种轻链组合。重链和轻链各自含有参与抗原结合的可变区(分别为VH和VL)以及恒定(C)区。抗原结合部位由6个超变区(亦称互补决定区(⑶R))组成。重链的3个⑶R和轻链的3个⑶R分别位于每条链的 4个称为构架区(FR1、FR2、FR3和FR4)的相对保守的反平行β-片层之间。按惯例，利用编号系统表示VH和VL链的组成部分的位置。Kabat定义以序列变异性为基础，而Chothia 定义以结构环区的位置为基础。对于由B细胞合成的每种类型Ig链，存在单独的称为种系基因的基因区段库，由其合成单条多肽链。每个库位于不同的染色体上，通常含有较大量的编码V区的基因区段和较少量的编码C区的基因区段。每个轻链V区由两种种系基因区段(即一条长的V基因区段、一条短的连接(J)基因区段)和C区段装配的核酸序列编码。重链由4种种系基因区段编码，3种编码可变区，一种编码恒定区。编码重链可变区的3种种系基因区段为V区段、J区段和多样性D区段。已经表征了人种系V、D和J基因序列。有大约51种人种系VH 基因区段(这类“区段”在本文中亦称为种系基因家族成员)，根据至少80%的序列同源性将其分类为7个种系基因家族(VH1-VH7)。参见例如Matsuda等，J. Exp. Med. (1998) 188 2151-2162。通过体细胞超突变(somatic hypermutation)(或抗体成熟)，每个种系基因家族成员可产生作为指定种系基因家族成员的衍生物的多种免疫球蛋白。可通过将体细胞突变的抗体的序列与种系基因的序列进行比对，以评价与种系基因家族成员的序列同一性， 从而确定由其得到体细胞突变抗体的种系基因家族成员。重链可变区的头两个⑶R和三个构架区由VH编码。⑶R3由VH的几个核苷酸、全部 DH和部分JH编码，而FR4由JH基因区段的其余部分编码。同样，对于轻链，V Kappa(VK) 或V Iambda(VA)基因区段(例如种系基因家族成员)编码V区的头两个CDR和3个构架区以及⑶R3的几个残基。J Kappa(JK)和J Lambda(JA)区段分别编码V κ或νλ区中的CDR3区的其余部分。编码κ链的DNA包括大约40种Vk区段(种系基因家族成员)， 根据序列同源性将其分成6个家族(V κ I-V κ VI)。编码λ链的DNA包括分成10个家族的大约31种νλ区段(种系基因家族成员)。参见附图说明图1、2、3和4。抗体和抗体片段已成为急性和慢性各种人类疾病的有前景的治疗药物。可利用若干方法产生抗体，包括杂交瘤技术、细菌展示、核糖体展示、酵母展示和人抗体片段在复制噬菌体表面的重组表达。可通过杂交瘤产生的单克隆抗体(mAb)多年来成功用作诊断剂，但其作为治疗药物的应用才刚刚兴起。绝大多数的mAb是非人类(主要为啮齿动物)来源的mAb，对人的免疫原性带来了问题。当把啮齿动物源的抗体给予人时，便产生抗啮齿动物抗体，导致从血清中清除啮齿动物抗体增加，阻碍了其治疗效果和超敏反应。这些局限性促使发展了称为“人源化”的工程技术。最早的人源化策略基于重链和轻链可变结构域负责结合抗原，而恒定结构域负责效应子功能的知识。例如，通过将啮齿动物mAb的可变结构域移植到人抗体的恒定结构域上来产生嵌合抗体(例如Neuberger M S等，Nature 314，268-70,1985和Takeda等， Nature 314，452_4，1985)。虽然这些嵌合抗体在人体内引起更好的效应子功能，而且免疫原性降低，但是啮齿动物可变区仍具有诱导免疫应答的风险。当认识到可变结构域由β片层构架和覆盖其上的抗原结合环(互补决定区，即CDR)组成时，便将人源化抗体设计成含有移植到人构架上的啮齿动物CDR。通常使用其中整个人构架区与啮齿动物序列同源性最接近的抗体，将若干不同的抗原结合部位成功转移到单一人构架上(例如Jones P T等， Nature 321,522-5,1986 ；Riechmann L.等，Nature 332，323-327，1988 ；以及 Sato K.等， Mol. Immunol. 31，371-8，1994)。或者，根据若干人重链构建了共有人构架(例如Carter P.等，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89，487-99，1992)。然而，单纯的CDR移植常常导致抗原亲和力的丧失。不得不考虑片层构架与抗原环之间的其它可能的相互作用以重建抗原结合部位(Chothia C 等，Mol. Biol. 196，901-917，1987)。若干抗体人源化所必需的基本构架残基的比较以及基于抗体晶体结构的计算机建模披露了很可能对结合部位的完整性产生影响的称为“Vernier区残基”的一组构架残基(Foote J.等，Mol Biol 224，487-99，1992)。另外，VH-VL界面区的若干残基可能对维持抗原的亲和力十分重要(Santos A D 等，Prog. Nucleic Acid Res Mol Biol 60，169-94 1998)。最初，将构架残基逐步突变成啮齿动物序列(Kettleborough C A等，Protein Engin. 4，773-783，1991)。然而，这种突变方法非常耗时，而且不能覆盖所有重要的残基。对于任何具体抗体，少部分的改变可满足结合最优化的需要，但是仍难以从 Vernier和VH/VL残基组中选择。组合文库法(combinatorial library approach)结合选择技术(例如噬菌体展示)通过产生人源化分子文库，对人源化技术进行了彻底的改革，所述人源化分子文库表示在所有重要的构架残基中啮齿动物与人序列之间的替代，并允许同时测定所有人源化形式的结合活性(例如Rosok M J，J Biol Chem，271，22611-8，1996和 Baca M 等，J Biol Chem 272，10678-84，1997)。显然，本领域需要产生免疫原性降低而同时保持最适结合特征、可以给予目标物种用于治疗和诊断目的的人源化抗体的改进方法。专利技术概述一方面，本专利技术提供用于产生杂交抗体可变结构域或其片段的方法，其中所述方法包括(i)从对靶标具有特异性的初始抗体可变区内的FR1、FR2和FR3中选择构架区； ( )将选定构架区与所述目标物种的候选供体构架序列进行比较，以鉴定与选定构架区具有高度同源性的第一供体构架序列；(iii)对第一供体构架序列与所述目标物种的种系序列进行比较，以鉴定与第一供体构架序列具有高度同源性的第一种系构架序列；(iv)在第一供体构架序列内鉴定出本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种用于产生杂交抗体可变结构域或其片段的方法，所述方法包括：（ｉ）从对靶标具有特异性的初始抗体可变区内的ＦＲ１、ＦＲ２和ＦＲ３中选择构架区；（ｉｉ）将选定构架区与所述目标物种的候选供体构架序列进行比较，以鉴定与选定构架区具有高度同源性的第一供体构架序列；（ｉｉｉ）对第一供体构架序列与所述目标物种的种系序列进行比较，以鉴定与第一供体构架序列具有高度同源性的第一种系构架序列；（ｉｖ）在第一供体构架序列内鉴定出至少一个氨基酸残基，其不同于第一种系构架序列相应位置上的氨基酸残基；和（ｖ）构建包含初始抗体的互补决定区（ＣＤＲ）和第一供体构架序列的杂交抗体可变结构域或其片段，其中第一供体构架序列内的至少一个氨基酸残基被第一种系构架序列相应位置上的氨基酸残基置换。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：R·P·罗瑟，
申请(专利权)人：阿雷克森制药公司，
类型：发明
国别省市：US
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