本发明专利技术公开了一种利用基因工程方法研制的一种用于白血病和自身免疫性疾病的抗体融合蛋白T1h-ONC，编码该融合蛋白的多核苷酸以及制备和纯化该融合蛋白的方法。该融合蛋白是由抗CD6的人源化单克隆抗体与豹蛙酶(ranpirnase)融合而成，在哺乳动物细胞中高效表达，且纯化工艺简短，有利于大规模制备。本发明专利技术的T1h-ONC抗体融合蛋白依然保留与CD6分子的结合特性，与CD6结合后，以免疫复合物的形式进入胞内，同时将豹蛙酶带入细胞内，降解tRNA，抑制蛋白质合成进而引起细胞凋亡。用于自身免疫性疾病及CD6阳性的白血病患者。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种抗体融合蛋白及其制备方法，特别是涉及一种重组的用于白血病和自身免疫性疾病的治疗用抗体融合蛋白，编码该抗体融合蛋白的核苷酸序列、载体、宿主细胞、制备方法及应用。属于生物工程
技术介绍
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性、炎性、系统性的自身免疫性疾病。该病在世界范围内普遍存在，以慢性、对称性、多发性滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现，好发于手、腕、足等小关节，反复发作，呈对称分布。早期有关节红肿热痛和功能障碍，晚期关节可出现不同程度的僵硬畸形，并伴有骨和骨骼肌的萎缩，极易致残， 是一种具有多种生理和临床特征的疾病。患病率美国为1 %，中国约0. 3% 0. 5%，男女之比约为1比4。患病高峰年龄30 50岁。RA患者自然病程生命期缩短5 10年，标准死亡率> 1. 5 (刘嘉玲，中国临床医生，2005，33 (5) :6_7·)。目前，RA的病因及确切的发病机理尚未明了，已有研究表明RA与免疫功能异常、 关节滑膜增生、关节软骨及骨组织破坏等密切相关。银屑病，是一种反复发作的、以表皮增殖和炎症为特征，无传染性的红斑鳞屑性皮肤病俗称“牛皮癣”，是皮肤科常见且易于复发的慢性炎症性疾病。其病因与遗传、感染、变态反应、代谢障碍及自身免疫等有关。该病病程长，外观丑陋，缠绵难愈，病程后期可侵犯多种脏器，给患者身心带来极大伤害而被皮肤科称为“不死的癌症”。临床主要分为4型 寻常型银屑病、关节型银屑病、脓疱型银屑病及红皮病型银屑病。据调查，牛皮癣的发病率占世界人口的0. -3%，该病在人群中的发病率白种人明显高于黄种人，黑种人次之。 1984年我国银屑病的患病率为0.123% (魏娟，黑龙江医学，2005，四(5) :344-346.)，国外一些地区更多，西北欧成人的患病率大约在1.5% 2.0%之间，日本在0.2% 1.0%之间(Menter A, Gottlieb A, Feldman SR, et al, J Am Acad Dermatol. 2008 May ；58 (5) 826-50.)。银屑病发病机制非常复杂。有多基因遗传背景，涉及到免疫、炎症、细胞增殖与凋亡、神经介质等多方面因素，尤其是作为银屑病皮损部位浸润细胞成分的T淋巴细胞在银屑病的免疫病理机制中扮演了中心角色。针对上述自身免疫性疾病，临床上已有很多种治疗药物，但或者由于疗效不稳定、 副作用过多，或者由于对肝脏、肾脏和骨髓的毒性并具致畸性而在临床应用上受到了极大的限制。因此，研制一种有效治疗类风湿性关节炎和银屑病等自身免疫性疾病的药物显得尤为重要。抗体药物由于其靶向性强、疗效独特、安全性耐受性好、使用安全、适合长期治疗， 在肿瘤和自身免疫性疾病等顽症的治疗方面具有其他药物无可比拟的优势，而成为目前生物药领域的研究热点。本专利技术的抗体融合蛋白正是基于白细胞分化抗原CD6分子在淋巴细胞成熟、活化和増殖中的重要作用而设计的，通过阻断CD6分子的功能可为类风湿性关节炎、银屑病等自身免疫性疾病及CD6阳性的白血病的治疗方面提供新的治疗手段和方法。研究表明，与 CD6分子表位3 (epitope)结合的UMCD6单克隆抗体能够抑制破伤风类毒素(TT)抗原特异的T细胞克隆和药物诱导的自身反应性T細胞克隆的増殖。CD6是I型跨膜糖蛋白，胞外区有3个富含半胱氨酸的功能区重复序列，属于 SRCRSF 家族，CD6 有 105/110KD 和 130KD 两种异构型(Alejandro Aruffo, Michael B, Melnick, et al.，J Exp Med，1991，174 :949-952.)。CD6 分子序列全长 668 个氨基酸 (Robinson WH, Neuman ae Vegvar HE,Prohaska SS,et al. ,Eur JImmunol,1995,25(10) 2765-2769.)，去除N-末端17个氨基酸信号肽序列后，⑶6分子胞外区385个氨基酸，胞外区至少有3个表位SRCR1、SRCR2和SRCR3。SRCR3是与其配体-激活白細胞粘附分子 (ALCAM)结合的部位；SRCR2或柄区具有稳定结合的作用。SRCR1、SRCR3与T细胞活化信号传导有关。跨膜区由23个疏水氨基酸組成；胞浆区244个氨基酸，含2个丝氨酸残基。 CD6胞浆区长短不一，但至少有ー个30KD的胞浆区尾并伴有多重磷酸化位点。在胸腺細胞分化及T細胞活化过程中，⑶6表达上调。多种物质能特异地调节⑶6表达，如ConA、PHA, PMA、IL-2 和抗 CD2 的单克隆抗体等(Robinson WH, Prohaska SS, Santoro JC, et al. J Immunol,1995，155(10) :4739-4748.)。古巴分子免疫中心(CIM)开发了抗人T淋巴細胞CD6分子的鼠源性单克隆抗体 ior-tl，由kzary综合症患者外周血单个核細胞免疫的小鼠得到鼠源的单抗ior-tl。临床前研究结果显示其在自身免疫性疾病治疗中有潜在价值和较好的安全性。CIM于1999年 2003年在古巴进行ior_tl治疗银屑病、类风湿性关节炎的I期、 II期临床试验。已有的临床研究结果表明以CD6分子为靶点治疗T淋巴細胞瘤、银屑病、 类风湿性关节炎的有效性较好；由于ior-tl是鼠源性单克隆抗体，在治疗中出现了较多不良反应，产生人抗鼠抗体反应(HAMA)。针对以上问题，CIM对ior-tl抗体进行人源化，以降低其在治疗中的不良反应。⑶6单抗的人源化通过基于T細胞抗原表位预测(detopes)的人源化技术完成， 在人源化过程中，鼠源IgG^i免疫蛋白(ior-tl)改造为人源化IgGl(Roque-NavarroL et al. · Hybrid Hybridomics. 2003 Aug ；22 (4)ッ45_57)，根据国际人源化抗体的命名规则该抗体被命名为Itolizumab (也称Tlh)。表面等离子共振(surface ρ lasmon resonance SPR)分别检测Tlh及其亲本抗体(ior-tl)亲和性，解离常数(Kd)分别是6. 84X 1(Γ8Μ 和6. 74X1(^M，人源化抗体保持了与亲本抗体相似的亲和力。人源化抗体Tlh及其亲本(ior-tl, Tlq)与外周血单个核細胞的识别率，阳性率分别达79. 7%和69.9%, Tlh抗体保留了与亲本抗体相同的识别特性；比较人源化抗体及其亲本(ior-tl，Tlq)在绿猴 (Cercopithecus aethiops)体内的免疫原性，人源化抗体Tlh的免疫原性明显低于其亲本；在兔子体内进行的药代动力学研究表明，Tlh抗体比其鼠源性抗体有更长的半衰期。上述实验表明将ior-tl改造为人源化抗体Tlh是成功的。由于人源化抗⑶6单抗(Tlh)具有上述特性，Tlh单抗已被古巴和印度批准用于自身免疫性疾病如银屑病和类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)的临床研究。人源化Tlh单抗于2003年在古巴批准进行RA治疗的I期临床研究，2007年基本完成I期临床研究；2007年在印度批准进行本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：白先宏，喻志爱，何伟，林峰，何丽华，李先钟，刘方杰，扈艳红，马金伟，韩海蛟，周俊杰，王康，
申请(专利权)人：百泰生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：
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