糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片及其制备、检测方法技术

本发明专利技术涉及生物医学研究及临床应用领域，具体涉及糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片及其制备、检测方法。本发明专利技术要解决现有糖尿病临床分型确诊不准确和检测成本高的问题。解决方案是：糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片，外壳是上表面设置有多个反应池的玻璃薄片，反应池内均设置有检测微阵列，每个检测微阵列分别由四个不同种类的、同一规格大小的蛋白微型固相检测片组成，所述蛋白微型固相检测片分别是胰岛细胞微型固相检测片、ＧＡＤ蛋白微型固相检测片、ＰＴＰ蛋白微型固相检测片和Ｉｎｓｕｌｉｎ蛋白微型固相检测片；制备方法是首先准备微型固相检测片，然后进行组装；检测方法是：先采用间接荧光法检测，结果再以生物芯片激光共聚焦扫描仪判定。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医学研究及临床应用领域，具体涉及。
技术介绍
糖尿病是目前危害人类健康与生活质量最严重的疾病之一，它以血糖浓度持续性增高为主要症状表现，通过多种严重并发症而危害健康。据国际糖尿病联盟(KDF)对全球糖尿病的发病现状及世界卫生组织(WHO)对糖尿病发病情况作出的最新预测指出，目前全球已诊断出II型糖尿病患者达1.3亿人，我国超过4000万人。预计到2025年，全球糖尿病患者将突破3亿，我国糖尿病患者总数接近1亿。在我国，随着经济生活水平的提高和饮食结构的改变，糖尿病患者人群正迅速发展，预防和治疗糖尿病已成为我国重大社会课题。 糖尿病依病因可分为两类，I型和II型，这两种类型的糖尿病起因不同、对患者的危害以及治疗方法都截然不同。早在80年代，就有人观察到一部分临床诊断为II型糖尿病患者在血液中可检出特异性的胰岛细胞自身抗体，这类患者易出现继发性的口服降糖药治疗失效，必须依赖胰岛素治疗。随后的大量研究表明，这类患者实际属于I型糖尿病中的免疫中介亚型，为一种起病晚的成人隐匿性I型糖尿病(LADA)，起病原因为自身免疫紊乱。但由于这类病人的临床表现与II型糖尿病很难鉴别，绝大多数医院又无相关抗体的检测手段，通常都诊断为II型糖尿病，从而使用不适当的II型糖尿病治疗方法，延误病情，导致患者健康乃至生命的损失。 在1999年，世界卫生组织(WHO)专家评议报告“糖尿病及其并发症的定义、诊断和分型”第一部分中提出了糖尿病新分型。其中，I型糖尿病被分为免疫中介型和特发型两个亚型，并指出，确诊免疫中介I型糖尿病，主要依赖在糖尿病患者中检出针对胰岛β细胞各种抗原的自身免疫抗体。人们目前已发现了多种与糖尿病相关的自身免疫抗体，其中最重要的自身免疫抗体包括胰岛细胞自身抗体(ICAs)；谷氨酸脱羧酶抗体(GADA)；蛋白酪氨酸磷酸酶样跨膜蛋白抗体(ICA512/IA-2)；胰岛素抗体(IAA)。因胰岛细胞自身抗体的出现远早于临床症状，在I型糖尿病临床的前期，多种自身抗体在外周血就可检测出，其最远时间可达8年，可及时预测未来I型糖尿病发生。对这类患者如采取相应治疗措施，会大大延缓发病时间，甚至最终改变疾病的预后。 糖尿病自身免疫抗体在检测中由于出现情况、时间和强度并不一致，而且各种自身免疫抗体单一检出率都不超过80％，所以，任何单一的检测都很可能造成实际患者的漏诊。因此，糖尿病自身免疫抗体必须联合检测，在临床上才可用于分型确诊，进而影响治疗和患者预后的重要实用价值。目前常规的糖尿病诊断仍是以临床症状结合血糖浓度和口服糖耐量实验等相对实验室指标来诊断，它已不适合进行分型确诊，同时因其自身原因常会受到各种因素的干扰，有时会产生波动较大的检测结果，也就是说检测结果不稳定。另外已有人尝试采用特异性的血清免疫学方法来辅助分型诊断，但一般都是针对每种自身免疫抗体进行单独检测，因此检测成本高，一般患者难以采用，同时也难以作为体检筛查的手段，不能提供适应目前糖尿病患者增加所需要的相应的高通量标准化检测手段。
技术实现思路
本专利技术要解决现有糖尿病临床分型确诊不准确和检测成本高的问题。 为解决现有的问题，本专利技术的解决方案是提供一种糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片，包括外壳1和检测微阵列3，其特殊之处在于，所述外壳1是上表面设置有多个反应池2的玻璃薄片，反应池内均设置有一个检测微阵列3，每个检测微阵列3分别由四种同一规格大小的微型固相检测片组成，所述的微型固相检测片分别是胰岛细胞微型固相检测片4、重组人谷氨酸脱羧酶65KD蛋白微型固相检测片5、重组人胰岛细胞抗原512蛋白微型固相检测片6和重组人胰岛素蛋白微型固相检测片7。 上述微型固相检测片大小在0.1mm2～9mm2之间。 上述玻璃薄片规格为22mm×75mm，厚度1mm～3mm，其上表面设置有3～200个反应池2，所述反应池2是边长为0.2mm～18mm的正方形。 上述反应池2容量为10μl～100μl。 上述胰岛细胞微型固相检测片4上包含有约1×103～1×106个胰岛细胞；所述每个蛋白微型固相检测片上包含有2个～10个相应的蛋白点样点。 一种上述的糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片的制备方法如下首先准备微型固相检测片，本专利技术中的微型固相检测片，根据其上的检测基质种类不同分为胰岛细胞微型固相检测片、重组人谷氨酸脱羧酶65KD蛋白微型固相检测片、重组人胰岛细胞抗原512蛋白微型固相检测片和重组人胰岛素蛋白微型固相检测片；这四个微型固相检测片的制备中，检测片采用经硅化处理的玻璃盖玻片或透明聚苯乙烯盖玻片或醋酸纤维膜，其中胰岛细胞微型固相检测片4的制备采用细胞体外培养技术结合细胞爬片技术，另外三种蛋白微型固相检测片的制备方法是依次包括将蛋白与磷酸盐缓冲液混合后调节蛋白溶液的浓度；将蛋白溶液再加入40％的甘油，混匀；采用市售的DNA微阵列仪点样仪在基质平面上点样；点样后孵育3小时；用牛血清白蛋白溶液封闭，使用时切割为0.1mm2～9mm2的微型检测片；然后进行组装①选用表面上设有3～200个反应池的玻璃薄片，每个反应池均为边长是0.2mm～18mm的正方形，容量10μl～100μl；②在反应池内设置有一个检测微阵列，由四个同一规格大小的不同种类的微型固相检测片排列并以透明黏合剂黏附固定于其内制成。 上述微型固相检测片的制备方案是①胰岛细胞微型固相检测片的制备首先选取对胰岛细胞自身抗体抗体敏感的体外培养细胞，所述的对胰岛细胞自身抗体抗体敏感的体外培养细胞包括胰岛细胞瘤手术切除组织培养的胰岛β细胞瘤细胞，以及哺乳动物胰腺组织内胰岛细胞；然后进行检测基质的培养培养方法是先参照胰岛细胞体外培养法进行原代培养，再在传代后使贴壁的单层培养细胞生长于检测片的表面，待细胞生长贴附整个检测片表面超过50％后，取出检测片，放入磷酸盐缓冲液洗涤，再于检测片表面滴加固定液固定30min，固定后浸入磷酸盐缓冲液-甘油混合液置于-20℃储存，使用时切割为0.1mm2～9mm2的微型检测片；②重组人谷氨酸脱羧酶65KD蛋白微型固相检测片的制备中，点样试剂采用美国sigma公司纯化重组人谷氨酸脱羧酶65KD蛋白，磷酸盐缓冲液稀释，pH7.5，终浓度范围在10μg～200μg/ml，加入40％甘油，混匀，采用微阵列点样仪点样。点样密度在100～2000点/cm2，点样后以含L型多聚谷氨酸的0.5％牛血清白蛋白封闭，-20℃储存。使用时切割为0.1mm2～9mm2的微型检测片，每个微型检测片含有2个～10个蛋白点样点； ③重组人胰岛细胞抗原512蛋白微型固相检测片的制备中，试剂采用美国sigma公司重组纯化重组人胰岛细胞抗原512蛋白β-亚型，磷酸盐缓冲液稀释，pH7.5，终浓度范围在10μg～200μg/ml，加入40％甘油，混匀，采用微阵列点样仪点样。点样密度在100～2000点/cm2，点样后以含L型多聚谷氨酸的0.5％牛血清白蛋白封闭，-20℃储存。使用时切割为0.1mm2～9mm2的微型检测片，每个微型检测片含有2个～10个蛋白点样点；④微型重组人胰岛素蛋白固相检测片的制备中，试剂采用美国sigma公司合成人胰岛素蛋白，磷酸盐缓冲液稀释，pH7.5，终浓度范围在10μg～20本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片，包括外壳（１）和检测微阵列（３），其特征在于：所述外壳（１）是上表面设置有多个反应池（２）的玻璃薄片，反应池内均设置有一个检测微阵列（３），每个检测微阵列（３）分别由四种同一规格大小的微型固相检测片组成，所述的微型固相检测片分别是胰岛细胞微型固相检测片（４）、ＧＡＤ蛋白微型固相检测片（５）、ＰＴＰ蛋白微型固相检测片（６）和Ｉｎｓｕｌｉｎ蛋白微型固相检测片（７）。

【技术特征摘要】
1.一种糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片，包括外壳(1)和检测微阵列(3)，其特征在于所述外壳(1)是上表面设置有多个反应池(2)的玻璃薄片，反应池内均设置有一个检测微阵列(3)，每个检测微阵列(3)分别由四种同一规格大小的微型固相检测片组成，所述的微型固相检测片分别是胰岛细胞微型固相检测片(4)、重组人谷氨酸脱羧酶65KD蛋白微型固相检测片(5)、重组人胰岛细胞抗原512蛋白微型固相检测片(6)和重组人胰岛素蛋白微型固相检测片(7)。2.如权利要求1所述的糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片，其特征在于所述微型固相检测片大小在0.1mm2～9mm2之间。3.如权利要求1或2所述的糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片，其特征在于所述玻璃薄片规格为22mm×75mm，厚度1mm～3mm，其上表面设置有3～200个反应池(2)，所述反应池(2)是边长为0.2mm～18mm的正方形。4.如权利要求3所述的糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片，其特征在于所述反应池(2)容量为10μl～100μl。5.如权利要求4所述的糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片，其特征在于所述胰岛细胞微型固相检测片(4)上包含有约1×103～1×106个胰岛细胞；所述每个蛋白微型固相检测片上包含有2个～10个相应的蛋白点样点。6.一种如权利要求1所述的糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片的制备方法，其特征在于首先准备微型固相检测片，本发明中的微型固相检测片，根据其上的检测基质种类不同分为胰岛细胞微型固相检测片、重组人谷氨酸脱羧酶65KD蛋白微型固相检测片、重组人胰岛细胞抗原512蛋白微型固相检测片和重组人胰岛素蛋白微型固相检测片；这四个微型固相检测片的制备中，检测片采用经硅化处理的玻璃盖玻片或透明聚苯乙烯盖玻片或醋酸纤维膜，其中胰岛细胞微型固相检测片的制备采用细胞体外培养技术结合细胞爬片技术，另外三种蛋白微型固相检测片的制备方法依次包括将蛋白与磷酸盐缓冲液混合后调节蛋白溶液的浓度；将蛋白溶液再加入40％的甘油，混匀；采用市售的DNA微阵列仪点样仪在基质平面上点样；点样后孵育3小时；用牛血清白蛋白溶液封闭；在使用时切割为0.1mm2～9mm2的微型检测片；然后进行组装①选用表面上设有3～200个反应池的玻璃薄片，每个反应池均为边长是0.2mm～18mm的正方形，容量10μl～100μl；②在反应池内设置有一个检测微阵列，由四个同一规格大小的不同种类的微型固相检测片排列并以透明黏合剂黏附固定于其内制成。7.如权利要求6所述的糖尿病自身免疫抗体检测复合芯片的制备方法，其特征在于所述微型固相检测片的准备中，①胰岛细胞微型固相检测片的制备首先选取对胰岛细胞自身抗体抗体敏感的体外培养细胞，所述的对胰岛细胞自身抗体抗体敏感的体外培养细胞包括胰岛细胞瘤手术切除组织培养的胰岛β细胞瘤细胞以及哺乳动物胰腺组织内胰岛细胞；然后进行检测基质的培养培养方法是先参照胰岛细胞体外培养法进行原代培养，再在传代后使贴壁的单层培养细胞生长于检测片的表面，待细胞生长贴附整个检测片表面超过50％后，取出检测片，放入磷酸盐缓冲液洗涤，再于检测片表面滴加固定液固定30min，固定后浸入磷酸盐缓冲液-甘油混合液置于-20℃储存，使用时切割为0.1mm2～9mm2的微型检测片；②重组人谷氨酸脱羧酶65KD蛋白微型固相检测片...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘镭，罗毅，王伟华，
申请(专利权)人：陕西超英生物医学研究开发有限公司，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]