本发明专利技术公开了一种髓样细胞表达激发受体-1(TREM-1)重组融合蛋白及其在制备治疗感染性炎症疾病药物中的应用，利用分子克隆和基因重组技术，从重症感染性休克患者和重症感染小鼠的外周血中，分别克隆人TREM-1胞外区域和小鼠TREM-1胞外区域，再分别采用酶切和PCR方法将人IgG?Fc段基因插入TREM-1胞外区域基因的下游位点，然后将融合片段插入原核表达载体的相应位点上，构建了重组原核表达质粒。小鼠和人的TREM-1重组融合蛋白的基因序列分别如SEQ?ID?NO：1和SEQ?ID?NO：3所示。本发明专利技术公开的蛋白基因易于修饰和改造、稳定性好、疗效显著，对感染性炎症疾病具有很高的预防和治疗作用。
【技术实现步骤摘要】
一种髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白及其应用
本专利技术涉及一种预防和治疗感染性炎症的药物，更具体地讲，涉及一种髓样细胞 表达激发受体-1的重组融合蛋白。
技术介绍
髓样细胞表达的激发受体(TREM)是免疫球蛋白超家族中的一个受体家族。 TREM-I于2001年在NATURE上首次报道，加深了人们对炎症反应的启动和发展过程的认识。 TREM-I能识别细菌、真菌这些病原体的表面受体，主要分布在外周血中性粒细胞和单核细 胞亚群，还选择性地表达在肺泡、肠液及其它体液的吞噬细胞上。TREM-I属跨膜糖蛋白，具 有胞外单链免疫球蛋白可变区(IgV)，含阳离子化赖氨酸残基的跨膜区和较短胞浆内尾段 的保守结构。TREM-IIgV能特异性与其配体或单克隆抗体结合，产生活化效应，跨膜区的赖 氨酸残基，可与接头蛋白DAP12跨膜区内的带负电荷的天冬氨酸相耦联，并通过DAP12胞浆 区中的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)来传递活化信号，转录编码促炎因子和细胞表面 分子的基因，最终导致细胞大量分泌促炎因子。文献报道，当革兰阳性菌、阴性菌或真菌所致的急性炎症和肉芽肿性炎症中，以及 内毒素(LPQ或其他微生物导致的感染性休克中，感染组织中渗出的中性粒细胞和单核细 胞表面的TREM-I表达明显升高。相反，对于那些非感染引起的免疫复合物炎症反应，如鳞 癣、溃疡性结肠炎和脉管炎等，则不会出现TREM-I的表达增加。在体外，用活细菌或其胞壁 成分与中性粒细胞和单核细胞共同培养，可诱导免疫细胞表面的TREM-I表达上调。生物学 实验证实，假手术组外周血中单核细胞和中性粒细胞、腹膜和脾脏的巨嗜细胞的TREM-I表 达没有明显改变。而脓毒血症组，所有效应细胞的TREM-I均出现特征性高表达(升高3到4 倍)。在脓毒性休克的病人，也证实了单核细胞TREM-I表达的不断增高。THE NEW ENGLAND 医学杂志上报道了 148例接受了机械通气或可疑社区获得性肺炎的病人，通过Western的 方法，快速检测患者支气管肺泡灌洗液中的可溶性TREM-I (sTREM-1)，有助于确诊或排除细 菌性或真菌性肺炎，支气管肺泡灌洗液中的可溶性TREM-I可作为独立诊断肺炎的金标准。小鼠体内TREM-I作用机制的研究证明，TREM-I扩大了细菌及真菌所致感染的炎 症反应效应，与下游细胞因子之间形成一个正反馈的自分泌调节回路，影响机体的天然免 疫，促使炎症反应增强放大。TREM-I介导的信号转导通路在炎症反应的级联放大和脓毒症 的发生中起着关键性的作用。国外学者们的大量基础研究，使TREM-I在炎症反应中的表达和诊断价值日益得 到重视，成为炎症反应的分子治疗靶点。小鼠脓毒性休克模型的实验表明，阻断TREM-I的 信号转导通路，可以明显降低小鼠的死亡率。根据TREM属于IgSF，TREM-I与IgG具有一定 的同源性，有构想TREM-I与IgG融合蛋白综合具有此两种免疫球蛋白的特性，这种融合蛋 白能与免疫细胞表面的TREM-I竞争性结合TREM-I配体，从而起到抑制活化信号的诱骗受 体的作用，是目前TREM研究的热点。美国专利US 6420526 “186个分泌蛋白质”要求保护未指明而且未加例证的分离的TREM-I片段，其包含人TREM-I至少30个连续的氨基酸，没有提供与这些片段相关的生 物学数据。申请号200510104693. X公布了一种“治疗性肽和方法”，提供了一种多肽，其序 列为天然TREM-I蛋白序列中的一个或多个部分序列，该肽段在生物化学研究所定购并人 工合成。没有提供TREM-I重组融合蛋白的序列和制备工艺，没有提供TREM-I重组融合蛋 白治疗感染性炎症疾病的实施例。感染性疾病是医学和兽医界最常见的疾病之一，各种革兰阳性菌、阴性菌或真菌 所致病种不胜枚举，现多采用以抗生素治疗为主的综合治疗方案。天然免疫应答是机体抗 感染的第一道防线，切断病原体和受体的识别，阻断炎症反应的信号转导通路，在解决感染 性炎症疾病方面有巨大潜力。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种小鼠或人的髓样细胞表达激发受体-1重组融合蛋白。本专利技术的第二个目的在于提供一种髓样细胞表达激发受体-1重组融合蛋白的制 备方法。本专利技术的第三个目的在于提供一种髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白在 制备治疗动物或人感染性炎症疾病药物中的应用。为实现上述目的，本专利技术公开以下技术方案一种髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白，具有与天然TREM-I相似的结构， 通过酶切位点连接TREM-I胞外区段和IgGFc段，所述融合蛋白具备两种免疫球蛋白的特 性，能与免疫细胞表面的TREM-I竞争性结合TREM-I配体。小鼠髓样细胞表达激发受体-1重组融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO=I所示。人髓样细胞表达激发受体-1重组融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO 3所示。此重组融合蛋白的基因序列包括TREM-I胞外区段和人IgGFc段的功能区段，并由 酶切位点连接。此酶切位点可为任意一种或多种酶切位点或保护性碱基。在TREM-I胞外 区段或人IgGFc区段中增加或删减序列，能实现该区段功能，能实现本专利技术的目的，得到与 本专利技术公开的序列大致相似的基因序列的，都应视为本专利技术的保护范围。髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白的制备方法，包括(1)克隆小鼠 TREM-I胞外区域和人IgG Fc段，将IgG Fc段基因插入TREM-I胞外区域基因的下游位点得 到融合片段；(2)将所述融合片段插入原核表达载体的相应位点上，构建重组原核表达质 粒；C3)构建的重组原核表达质粒分别转化受体菌，经IPTG诱导表达，对蛋白表达产物进行 纯化，应用SUMO蛋白酶，其特征在于步骤O)中所述表达载体为pet-28a-HiS-Sum0 ；步骤(3)中所述蛋白表达时，IPTG 37°C诱导4_6小时，优选4小时。步骤(3)中所述蛋白表达的条件为(1)将新抽的质粒转入BL21(DE3)中，37°C培 养过夜；(2)挑取单克隆，37°C LB培养10小时；(3)转入到500ml LB培养基中，22°C培养 3-4小时，菌体浓度达到0. 6后加入IPTG，终浓度为10 μ Μ,培养4小时;步骤(3)中所述蛋白产物纯化，酶切去除SUMO蛋白酶的条件为温度4-10°C，时 间12-16小时；优选4°C酶切12小时。髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白在制备治疗动物感染性炎症疾病药物 中的应用。髓样细胞表达激发受体-1的重组融合蛋白在制备治疗人感染性炎症疾病药物中 的应用。本专利技术的积极效果本专利技术人提供的利用基因工程技术构建表达的TREM-I重组融合蛋白，相对于人 工合成肽段，具有可增加蛋白质分子在血液中半衰期，便于纯化检测，兼具TREM-I与IgG 融合蛋白两种免疫球蛋白的特性，生物功能多样等特点。可溶性TREM-1/IgG结构与天然 TREM-I结构相似，能与免疫细胞表面的TREM-I竞争性结合TREM-I配体，从而起到抑制活化 信号的诱骗受体的作用，阻断TREM-I介导的炎症信号转导通路。本专利技术公开的蛋白基因易于修饰和改造、稳定性好、制备简单、疗效显著，对感染 性炎症疾病具有很高的预防和治疗作用。附图说明图1为小鼠T本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种髓样细胞表达激发受体－１的重组融合蛋白，具有与天然ＴＲＥＭ－１相似的结构，其特征在于：通过酶切位点连接ＴＲＥＭ－１胞外区段和ＩｇＧＦｃ段，所述融合蛋白具备两种免疫球蛋白的特性，能与免疫细胞表面的ＴＲＥＭ－１竞争性结合ＴＲＥＭ－１配体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：路筝，李兆申，刘岩，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：31
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