TRAIL R2-特异性多聚体支架制造技术

本发明专利技术提供了特异性结合TRAIL受体2(TRAIL?R2)(参与细胞凋亡的细胞膜受体)的基于腱糖蛋白-3FnIII结构域的多聚体支架。本发明专利技术还提供了具有增强的对于靶的亲和力、增强的稳定性和减小的免疫原性的工程变体。此外，本发明专利技术还涉及作为预防剂、治疗剂或诊断剂的工程多价支架以及它们抗由表达TRAIL?R2的细胞引起的疾病的用途，特别地涉及抗癌的治疗性用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】TRAILR2-特异性多聚体支架专利技术背景参考序列表本申请通过引用以标题为“2943.011PC02_sequence_listing.txt”的文本文件(于2011年4月12日创建的并且大小为211千字节)与本申请一起通过EFS-Web提交的序列表将其并入本文。专利
本专利技术总体上涉及抗体模拟物的领域，具体地涉及用于例如产生具有新型结合特征的产物的基于纤连蛋白III型(Fn3)结构域的多聚体支架。具体地，本专利技术涉及衍生自人胰糖蛋白C的第3FnIII结构域的TRAILR2-特异性多聚体支架，以及它们用于TRAILR2受体检测和TRAILR2-介导的功能的调节例如癌症和其它障碍的治疗的用途。背景领域能够特异性结合期望的靶表位的生物分子具有作为治疗剂、研究和医学诊断工具的极大重要性。该类分子的公知实例为抗体。可选择特异性结合几乎任何结构表位和具有对于所述表位的亲和力的抗体。然而，经典抗体是难以在简单真核系统中表达的结构复杂的异源四聚体分子。因此，大多数抗体使用复杂且昂贵的哺乳动物细胞表达系统来产生。具有相对确定的三维结构的蛋白质(通常称为蛋白质支架)可用作用于设计工程产物的试剂。其中这类支架是有用的一个具体领域是抗体模拟物设计的领域。抗体模拟物，即小的非抗体蛋白质治疗剂，利用抗体和抗体片段的有利方面，例如对靶的高亲和力结合以及低免疫原性和毒性，同时避免一些缺点，例如抗体片段聚集的倾向以及不如全长IgG稳定。这些缺点可通过使用通过除去抗体天然折叠的部分产生的抗体片段来解决。然而，当通常包埋在疏水环境例如可变结构域与恒定结构域之间的界面中的氨基酸残基变得暴露于溶液时，这通常引起聚集。基于支架的抗体模拟物的一个实例基于III型(FnIII)的纤连蛋白模块(在门(phyla)间和蛋白质种类间(例如在哺乳动物的血液和结构蛋白质中)被广泛发现的结构域)的结构。TRAIL(肿瘤坏死因子相关细胞凋亡诱导配体，在文献中也称为Apo2L和TNFSF10)属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族并且已被鉴定为肿瘤细胞的程序化细胞死亡或细胞凋亡的激活物。TRAIL的膜结合和可溶性形式都能够通过与位于靶细胞上的TRAIL受体相互作用来触发细胞凋亡。在人中，已鉴定了5个受体具有对TRAIL的结合活性。在TRAIL对TRAILR1或TRAILR2结合后，触发了半胱天冬酶相关的细胞死亡。鉴于该细胞死亡活性，正在寻找基于TRAIL的治疗方法。已开发了几种基于TRAIL或TRAILR1或R2人激动抗体的治疗性方法，然而，TRAIL具有极短的寿命，其结合诱饵受体，并且抗体的大尺寸可限制它们的肿瘤渗透。因此，存在对可结合TRAIL受体的新型分子、包含此类分子的药物组合物、用于筛选此类分子的方法以及用于在许多癌症的治疗性治疗中使用此类分子的方法的需要。本文中的参考资料的引述或论述不应当被解释为这对于本专利技术是现有技术的承认。专利技术概述本专利技术提供了包含2个Tn3单体支架的TRAILR2-特异性重组多聚体支架，其中(a)每一个Tn3单体支架包含命名为A、B、C、D、E、F和G的7个β链，和6个命名为AB、BC、CD、DE、EF和FG的环区域，(b)Tn3单体支架以串联形式连接，以及(c)重组多聚体支架特异性结合TRAILR2。在一些实施方案中，TRAILR2-特异性多聚体支架包含3、4、5、6、7或8个Tn3单体支架。在一些其它实施方案中，本专利技术的TRAILR2-特异性多聚体支架中的所有Tn3单体支架以串联形式存在。在一些实施方案中，TRAILR2-特异性多聚体支架的至少一个Tn3单体支架通过接头或通过异源部分直接连接于1、2、3、4、5、6或7个其它Tn3单体支架。在某些实施方案中，TRAILR2-特异性多聚体支架直接连接而无间插在Tn3单体支架之间的接头。在一些实施方案中，TRAILR2-特异性多聚体支架的至少2个Tn3单体支架通过接头连接。在一些实施方案中，接头包含肽接头。在一些实施方案中，肽接头是柔性肽接头。在某些实施方案中，肽接头包含(GxS)y序列，其中x和y为整数，其中x=1、2、3或4，并且其中y=1、2、3、4、5、6或7。在一些实施方案中，本专利技术的TRAILR2-特异性多聚体支架对TRAILR2的结合与TRAILR2特异性Tn3单体支架的所述结合相比较得到了增强。在一些实施方案中，TRAILR2-特异性多聚体支架对TRAILR2的结合与TRAILR2特异性Tn3单体支架的所述结合相比较增强了对靶的作用。在一些实施方案中，本专利技术的TRAILR2特异性支架对TRAILR2的结合相对TRAILR2特异性Tn3单体支架的所述结合的增强是结合亲和力的增强和/或结合亲合力的增强。在其它实施方案中，对于TRAILR2的结合亲和力和蛋白质稳定性相对于TRAILR2特异性Tn3单体支架的所述结合亲和力和蛋白质稳定性得到了增强。在一些实施方案中，对于TRAILR2的结合亲合力和蛋白质稳定性相对于TRAILR2特异性Tn3单体支架的所述亲合力和蛋白质稳定性得到了增强。在一些实施方案中，TRAILR2-特异性多聚体支架包含含有功能性部分的接头。在一些实施方案中，功能性部分为免疫球蛋白或其片段。在某些实施方案中，免疫球蛋白或其片段选自：Fab片段、Fab'片段、Fd片段、Fd'片段、Fv片段、dAb片段、F(ab')2片段、scFv、双链抗体、线性抗体、全长抗体、Fc区域及所述部分的两个或更多个的组合。在某些实施方案中，免疫球蛋白或其片段包含IgG的Fc结构域和铰链区。在其它实施方案中，免疫球蛋白或其片段还包含CH1结构域。在一些实施方案中，免疫球蛋白或其片段包含Cκ结合域或Cλ结构域。在一些实施方案中，TRAILR2-特异性多聚体支架的Tn3单体支架的至少一个融合于异源部分。在一些实施方案中，异源部分包含选自如下物质的组合物：蛋白质、肽、蛋白质结构域、接头、药物、毒素、细胞毒素剂、成像剂、放射性核素、放射性化合物、有机聚合物、无机聚合物、聚乙二醇(PEG)、生物素、人血清白蛋白(HSA)、HSAFcRn结合部分、抗体、抗体的结构域、抗体片段、单链抗体、结构域抗体、白蛋白结合结构域、酶、配体、受体、结合肽、非-FnIII支架、附加表位、重组多肽聚合物、细胞因子以及所述部分的两种或更多种的组合。在一些具体实施方案中，将TRAILR2-特异性多聚体支架缀合于PEG。在其它实施方案中，超过2个Tn3单体支架通过接头连接并且至少一个接头在结构上和/或功能上与另外的接头不同。在一些实施方案中，TRAILR2-特异性多聚体支架中的Tn3单体支架以分枝形式连接。在其它实施方案中，本专利技术的TRAILR2-特异性多聚体支架中的一些Tn3单体支架以线性串联方式连接并且一些Tn3单体支架以分枝形式连接。在一些实施方案中，TRAILR2-特异性多聚体支架中的至少2个Tn3单体支架是相同的。在其它实施方案中，TRAILR2-特异性多聚体支架中的至少2个Tn3单体支架是不同的。在一些实施方案中，本专利技术的TRAILR2-特异性多聚体支架结合至少另外的靶，其可以是T细胞抗原。在一些实施方案中，该T细胞抗原为CD40L。在一些实施方案中，本专利技术的TRAILR2-特异性多聚体支架为受体激动本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.04.13 US 61/323,7081.一种包含以线性串联形式连接的六个TRAILR2特异性Tn3单体支架的TRAILR2-特异性重组多聚体支架，其中(a)每一个Tn3单体支架包含命名为A、B、C、D、E、F和G的7个β链，连接命名为AB、BC、CD、DE、EF和FG的6个环区域，其中：(i)AB环是SEQID：35的序列，BC环是SEQIDNO：97序列，CD环是SEQIDNO：37的序列，DE环是SEQIDNO：179的序列，EF环是SEQIDNO：39的序列，FG环是SEQIDNO：170的序列，(ii)AB环是SEQID：35的序列，BC环是SEQIDNO：97序列，CD环是SEQIDNO：37的序列，DE环是SEQIDNO：102的序列，EF环是SEQIDNO：39的序列，FG环是SEQIDNO：106的序列，(iii)AB环是SEQID：35的序列，BC环是SEQIDNO：97序列，CD环是SEQIDNO：37的序列，DE环是SEQIDNO：102的序列，EF环是SEQIDNO：39的序列，FG环是SEQIDNO：108的序列，或(iv)AB环是SEQID：35的序列，BC环是SEQIDNO：97序列，CD环是SEQIDNO：37的序列，DE环是SEQIDNO：102的序列，EF环是SEQIDNO：39的序列，FG环是SEQIDNO：170的序列，且β链A、B、C、D、E、F和G的序列分别为IEV、ALITW、CELAYGI、TTIDL、YSI、YEVSLIC和KETFTT；(b)所述Tn3单体支架以线性串联形式连接；(c)所述重组多聚体支架特异性结合TRAILR2；且(d)所述Tn3单体支架具有至少一个二硫键来连接所述7个β链其中两个。2.根据权利要求1所述的多聚体支架，其中所述多聚体支架包含7或8个TRAILR2特异性Tn3单体支架。3.根据权利要求1所述的多聚体支架，其中至少2个Tn3单体支架直接连接而无间插在所述Tn3单体支架之间的接头。4.根据权利要求1所述的多聚体支架，其中至少2个Tn3单体支架通过接头连接。5.根据权利要求4所述的多聚体支架，其中所述接头包括肽接头。6.根据权利要求5所述的多聚体支架，其中所述肽接头为柔性肽接头。7.根据权利要求5所述的多聚体支架，其中所述肽接头包含(GxS)y序列，其中x和y为整数，其中x＝1、2、3或4，并且其中y＝1、2、3、4、5、6或7。8.根据权利要求1-7中任一项所述的多聚体支架，其中，所述多聚体支架对于TRAILR2的结合与TRAILR2特异性Tn3单体支架对于TRAILR2的结合相比较得到了增强。9.根据权利要求1-7中任一项所述的多聚体支架，其中所述多聚体支架对于TRAILR2的结合与TRAILR2特异性Tn3单体支架对于TRAILR2的结合相比较增强了对所述靶的作用。10.根据权利要求8所述的多聚体支架，其中对TRAILR2的结合相对于TRAILR2特异性Tn3单体支架对于TRAILR2的结合的增强为结合亲和力的增强和/或结合亲合力的增强。11.根据权利要求8所述的多聚体支架，其中对于TRAILR2的结合亲和力和蛋白质稳定性与TRAILR2特异性Tn3单体支架对于TRAILR2的结合亲和力和蛋白质稳定性相比较得到了增强。12.根据权利要求8所述的多聚体支架，其中对于TRAILR2的结合亲合力和蛋白质稳定性与TRAILR2特异性Tn3单体支架对于TRAILR2的...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·巴卡，T·迪斯泰德，J·斯维斯，D·泰斯，
申请(专利权)人：米迪缪尼有限公司，
类型：
国别省市：