与细胞膜神经节苷脂相互作用的嵌合肽制造技术

本发明专利技术涉及嵌合肽，其表现出α‑突触核蛋白和β‑淀粉样肽二者的神经节苷脂结合性质。这样的肽可用于预防或治疗涉及神经节苷脂作为细胞表面受体位点的任何病症，包括神经退行性障碍、感染性疾病或肿瘤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及与细胞表面糖脂相互作用并且在神经退行性障碍、感染性疾病和癌症中具有治疗应用的嵌合肽。
技术介绍
质膜糖脂充当范围广泛的感染性和淀粉样蛋白质的主要附着位点(Fantini，2003)。例如，GM1和GM3这两种神经节苷脂参与阿尔茨海默氏病和帕金森氏病的病理生理(Oikawa等，2009；Wu等，2012)。在与帕金森氏病相关的蛋白质——α-突触核蛋白的糖脂结合特异性的最新研究中，Fantini等鉴定到所述蛋白质的34-45片段是最短的活性糖脂结合结构域(Fantini和Yahi，2011a)。这种12个氨基酸残基的短的线性基序赋予所述蛋白质与GM3相互作用的高特异性，GM3是由星形胶质细胞优先表达的神经节苷脂。这种基序与阿尔茨海默氏β-淀粉样肽(Aβ)的5-16片段具有结构同源性。然而Aβ的糖脂结合结构域不识别GM3，而是GM1，一种在突触后膜水平处丰富表达的神经节苷脂。
技术实现思路
本专利技术人现在已经破译了控制Aβ和α-突触核蛋白的糖脂结合特异性的生物化学密码并且已经制造了显示出这两种蛋白质的神经节苷脂结合性质的嵌合肽。本专利技术因而提供了一种肽，其包含a)氨基酸序列E-X1X2X3-YVGHH-X4(SEQ ID NO：9)，其中X1、X2或X3中的至少一个是甘氨酸或丝氨酸残基，同时X1、X2或X3中其余的是任何氨基酸；并且X4是苏氨酸或谷氨酰胺；b)从SEQ ID NO：9通过一个或多个保护所述肽对抗蛋白水解的化学修饰而衍生的序列，或c)从SEQ ID NO：9通过一个或多个保守性取代而衍生的基本上同源的序列，应了解，所述肽包含两个连续的组氨酸残基。所述肽具有10至30个氨基酸。在优选实施方式中，本专利技术提供了一种肽，其优选包含12至20个氨基酸，所述肽包含a)氨基酸序列EGVLYVGHHT(SEQ ID NO：1)，或b)从SEQ ID NO：1通过一个或多个保护所述肽对抗蛋白水解的化学修饰而衍生的序列，或c)从SEQ ID NO：1通过一个或多个保守性取代而衍生的基本上同源的序列，应了解，所述肽包含两个连续的组氨酸残基。优选的肽由KEGVLYVGHHTK(SEQ ID NO：3)组成。这样的肽可用于预防或治疗涉及神经节苷脂作为细胞表面受体位点的任何病症，包括神经退行性障碍、感染性疾病或肿瘤。本专利技术的另一个目的是编码如本文中定义的嵌合肽的核酸。本专利技术的又一个目的是包含所述核酸的载体，其优选是腺病毒或慢病毒载体。附图说明图1A和1B显示了His-13和His-14残基二者都参与Aβ5-16与GM1的结合。A.在17.5mN.m-1的初始表面压力下制备神经节苷脂GM1的单层。在平衡之后，将野生型Aβ5-16(空心方块)、或突变体Aβ5-16/H13A(实心三角)、Aβ5-16/H14A(实心圆)、Aβ5-16/H13A/H14A(空心三角)肽注入到所述单层下方的面下水相(aqueous subphase)中。数据显示了在所述单层下方的面下水相中注入肽(10μM)后，所述表面压力的演变。每个实验以一式三份进行并显示了一条代表性的曲线(S.D.<10％)。B.Aβ5-16与两个排列成高脚杯样托的GM1分子相互作用的分子模型。图1C显示了嵌合α-syn34-45/HH肽和高脚杯状GM1二聚体之间的分子相互作用。图2：在α-syn的SBD内引入His残基不改变GM3识别并增加它对GM1的亲和性。左图.野生型α-syn34-45(实心三角)和双重突变体α-syn34-45/HH(空心方块)与GM3(A)或GM1(C)单层相互作用的动力学。在每种情况下，在17.5mN.m-1的初始表面压力下制备所述单层。所有实验以一式三份进行并显示了一条代表性的曲线(S.D.<15％)。右图.野生型α-syn34-45(实心三角)和双重突变体α-syn34-45/HH(空心方块)与在各种初始表面压力值下制备的GM3(B)或GM1单层(D)的相互作用。在达到平衡之后测定最大表面压力增加(Δπmax)。插入临界压力由斜率与x轴的截距指示。图3A和3B显示了野生型和嵌合的α-syn34-45肽的分子建模。A.野生型(左图)或嵌合的α-syn34-45/HH(右图)肽的正静电势表面的可视化。B.野生型(左图)或嵌合的α-syn34-45/HH(右图)肽与神经节苷脂GM1单体或二聚体相互作用的分子建模模拟。图4A和4B显示了α-syn34-45/HH-GM1复合体的分子建模研究的实验验证。A.嵌合的α-syn34-45/HH肽与GD1a(实心方块)、GM1(空心方块)、脱唾液酸-GM1(实心三角)、LacCer(空心圆)和GlcCer(空心三角)在单层试验中的相互作用(实验条件与图1A相同)。B.α-syn34-45/HH与GM1：胆固醇或GM1：磷脂酰胆碱(1：1，mol：mol)的混合单层的相互作用。图4C：α-syn34-45/HH对GM1单层的插入临界压力的确定。在各种初始表面压力πi值下制备GM1单层并用添加到面下水相中的所述嵌合α-syn34-45/HH肽探查。记录平衡时的最大表面压力增加Δπmax。插入临界压力πc(37.5mN.m-1)被确定为线性回归斜率与x轴的截距。图5：α-syn34-45/HH或α-syn34-45对淀粉样蛋白孔隙形成的影响。A.在第一个实验中，将SH-SY5Y细胞用Aβ1-42肽(220nM)处理，并分析Ca2+依赖性荧光(上曲线)。在第二个系列的实验中，将Aβ1-42和嵌合α-syn34-45/HH肽(二者均为220nM)即时混合，直接注入到所述细胞上(C1和C2曲线对应于两个分开的实验)。C3曲线对应于由所述嵌合肽单独诱导的钙响应。结果表示为平均值±SD(n＝100)。在图B中，使用相同的颜色，但是所述嵌合肽被野生型α-syn34-45肽代替。图6：嵌合肽α-syn34-45/HH通过纯bEnd-3细胞单层的跨内皮穿过动力学。将所述细胞培养在两隔室培养腔的滤器上，直至形成跨内皮电阻>100Ω.cm2的紧密单层。在时间0时，将所述肽(600μM)注入下隔室，它在上隔室中的出现通过分光光度法定量测定。图7：嵌合肽α-syn34-45/HH通过与C6细胞共同培养的bEnd-3细胞单层的跨内皮穿过动力学。在这种情况下，在培养在下隔室塑料壁上的神经胶质C6细胞存在下，在两隔室培养腔的滤器上培养bEnd-3细胞。当bEnd-3细胞形成跨内皮电阻>100Ω.cm2的紧密单层时，将所述滤器转移到新的培养板中，然后在没有C6细胞的条件下进行实验。在时间0时，将所述肽(600μM)注入下隔室，它在上隔室中的出现通过分光光度法定量测定。图8：嵌合肽α-syn34-45/HH通过与CTX细胞共同培养的bEnd-3细胞单层的跨内皮穿过动力学。实验与图7中所述相同，但是使用最初在星形胶质细胞CTX细胞存在下共同培养的bEnd3-细胞。图9：嵌合肽α-syn34-45/HH通过血脑屏障的三种体外模型的跨内皮穿过动力学。血脑屏障的细胞模型是：单独的bEnd-3细胞(b)，与C6细胞共同培养的bEnd-3细胞(c)或与C6细胞共同培养的bEnd-本文档来自技高网...

【技术保护点】
10至30个氨基酸的肽，其包含a)氨基酸序列E‑X1X2X3‑YVGHH‑X4(SEQ ID NO：9)，其中X1、X2或X3中的至少一个是甘氨酸或丝氨酸残基，同时X1、X2或X3中其余的是任何氨基酸；并且X4是苏氨酸或谷氨酰胺；b)从SEQ ID NO：9通过一个或多个保护所述肽对抗蛋白水解的化学修饰而衍生的序列，或c)从SEQ ID NO：9通过一个或多个保守性取代而衍生的基本上同源的序列，应了解，所述肽包含两个连续的组氨酸残基。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.03.11 EP 14305353.61.10至30个氨基酸的肽，其包含a)氨基酸序列E-X1X2X3-YVGHH-X4(SEQ ID NO：9)，其中X1、X2或X3中的至少一个是甘氨酸或丝氨酸残基，同时X1、X2或X3中其余的是任何氨基酸；并且X4是苏氨酸或谷氨酰胺；b)从SEQ ID NO：9通过一个或多个保护所述肽对抗蛋白水解的化学修饰而衍生的序列，或c)从SEQ ID NO：9通过一个或多个保守性取代而衍生的基本上同源的序列，应了解，所述肽包含两个连续的组氨酸残基。2.权利要求1的肽，其优选具有12至20个氨基酸，并且其包含a)氨基酸序列EGVLYVGHHT(SEQ ID NO：1)，或b)从SEQ ID NO：1通过一个或多个保护所述肽对抗蛋白水解的化学修饰而衍生的序列，或c)从SEQ ID NO：1通过一个或多个保守性取代而衍生的基本上同源的序列，应了解，所述肽包含两个连续的组氨酸残基。3.权利要求1或2的肽，其中N-端和C-端氨基酸是碱性氨基酸，优选赖氨酸、精氨酸或组氨酸。4.权利要求3的肽，其包含X5-EGVLYVGHHT-X6(SEQ ID NO：2)或由X5-EGVLYVGHHT-X6(SEQ ID NO：2)组成，其中X5和X6独立地是赖氨酸、精氨酸或组氨酸。5.权利要求4的肽，其由KEGVLYVGHHTK(SEQ ID NO：3)组成。...

【专利技术属性】
技术研发人员：亚奎斯·凡蒂尼，诺拉·亚海，
申请(专利权)人：艾克斯马赛大学，
类型：发明
国别省市：法国;FR