具有促凋亡活性的抗GD2-O-乙酰化神经节苷脂的抗体制造技术

本发明专利技术涉及特异性结合O‑乙酰化‑GD2神经节苷脂的抗体或其功能片段及其在治疗中的用途，所述抗体包括：a)包括具有以下氨基酸序列的三个轻链互补区(CDR)的轻链：轻链CDR1：QSLLKNNGNTFL(SEQ id n°1)、轻链CDR2：KVS、轻链CDR3：SQSTHIPYT(SEQ id n°2)；和来自免疫球蛋白轻链的轻链框架序列，其中所述框架序列包含人κCL结构域；和b)包括具有以下氨基酸序列的三个重链互补区(CDR)的重链：重链CDR1：EFTFTDYY(SEQ id n°3)、重链CDR2：IRNRANGYTT(SEQ id n°4)、重链CDR3：ARVSNWAFDY(SEQ id n°5)；和来自免疫球蛋白重链的重链框架序列，其中所述框架序列包括来自人IgG1的CH2和CH3结构域和来自人IgG1的CH1结构域，所述CH1结构域经突变，以恢复在其他人IgG亚类中典型的CH1和轻链之间的配对，或所述CH1结构域由来自这样的非IgG1亚类如人IgG2、IgG3或IgG4的CH1结构域替换。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本国际专利申请要求于2013年11月11日提交的欧洲专利申请EP 13005298.8的优先权，其通过引用并入文本。
本专利技术提供了新抗体及其在癌症治疗中的用途。
技术介绍
先前已证实了神经外胚层起源的癌症特异性表达GD2-O-乙酰化神经节苷脂，以及可以施用靶向GD2-O-乙酰化神经节苷脂的治疗性抗体(mAb 8B6)并且尤其由于健康细胞特别是外周神经上不存在这种癌症抗原的表达，显示出有益效果，而没有神经毒性。抗OAcGD2鼠IgG3，κmAb 8B6的有效活性已经在Alvarez-Rueda等人(PLoS One，vol.6(9)，p:e25220，2011)中描述。该抗体在体外具有有效的ADCC和CDC活性，还显示出促凋亡活性(COCHONNEAU等，Cancer Lett.，vol.333(2)，p:194-204，2013)。该抗体通过细胞凋亡途径诱导细胞死亡，该细胞凋亡途径对应于在体外经由细胞周期停滞和细胞凋亡抑制培养的OAcGD2阳性肿瘤细胞增殖。用mAb 8B6针对OAcGD2进行的被动免疫治疗有效地抑制三种动物模型中表达OAcGD2的肿瘤的生长。证实了NK细胞的裂解功能对于mAb 8B6的体内活性不是必要的(上面提到的COCHONNEAU等，2013)。目前，为了开发人源化抗体，本专利技术人已生成了人-鼠嵌合抗体，命名为c8B6(IgG1，κ)。虽然这种c8B6抗体显示出与在具有免疫能力的小鼠肿瘤模型中相当的体内活性，但是在体外观察到与鼠mAb 8B6相比完全丧失的促凋亡活性。因此设想，mAb c8B6的促凋亡活性的丧失是由鼠IgG3和人IgG1之间不同的特定结构的损失造成的。因此，得出的结论是为了获得有价值的治疗不能进行人IgG1嵌合。
技术实现思路
现在，本专利技术人惊讶地发现c8B6的CH1γ1的特定突变或其由CH1γ3的替换使得恢复了促凋亡活性。因此，在c8B6中，似乎由于在人CH1γ1结构域的第133位附近缺少半胱氨酸，人IgG1的轻链和重链之间非典型的配对与这种抗体的促凋亡活性的丧失相关。因此，所获得的抗体包括IgG1特性，即ADCC活性和长半衰期以及促凋亡活性的良好组合。因此，本专利技术涉及识别O-乙酰化-GD2神经节苷脂的抗体或其功能片段，所述抗体包括：a)轻链，其包括具有以下氨基酸序列的三个轻链互补区(CDR)：i)轻链CDR1：QSLLKNNGNTFL(SEQ id n°1)；ii)轻链CDR2：KVS；iii)轻链CDR3：SQSTHIPYT(SEQ id n°2)；和来自免疫球蛋白轻链的轻链框架序列，其中所述框架序列包含人κCL结构域；和b)重链，其包含具有以下氨基酸序列的三个重链互补区(CDR)：i)重链CDR1：EFTFTDYY(SEQ id n°3)；ii)重链CDR2：IRNRANGYTT(SEQ id n°4)；iii)重链CDR3：ARVSNWAFDY(SEQ id n°5)；和来自免疫球蛋白重链的重链框架序列，其中所述框架序列包括：1)来自人IgG1的CH2和CH3结构域，和2)来自人IgG1的CH1结构域，所述CH1结构域经突变以恢复在其他IgG亚类中典型的CH1和轻链之间的配对，或所述CH1结构域由来自非IgG1亚类如人IgG2、IgG3或IgG4的CH1结构域替换。本专利技术还涉及包括至少一种这样的抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。另外，本专利技术涉及用于治疗癌症的方法，包括向有需要的患者提供这样的药物组合物，所述药物组合物包含至少一种所述抗体或至少一种其功能片段。另外，本专利技术涉及至少一种这样的抗体或至少一种其功能片段在用于制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途。最后，本专利技术涉及一种用于提高特异性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂的人IgG1抗体、其衍生物或功能片段的疗效的方法，其包括使来自所述抗体的人CH1γ1结构域突变的步骤，以恢复在其他IgG亚类中典型的CH1和CL结构域之间的配对，或通过由来自人IgG2(CH1γ2)、IgG3(CH1γ3)或IgG4(CH1γ4)的CH1结构域替换所述人CH1γ1结构域。附图说明图1显示了c8B6抗体的轻链和重链序列。图2显示了301.14a抗体的CH1和铰链结构域的序列。图3显示了301.14b抗体的CH1和铰链结构域的序列。图4显示了301.15抗体的CH1和铰链结构域的序列。图5显示了301.16抗体的CH1和铰链结构域的序列。图6显示了301.17抗体的CH1和铰链结构域的序列。图7显示了301.18抗体的CH1和铰链结构域的序列。图8显示了301.19抗体的CH1和铰链结构域的序列。图9显示了301.15b抗体的CH1和铰链结构域的序列。图10显示了301.20抗体的CH1和铰链结构域的序列。图11显示了301.21抗体的CH1和铰链结构域的序列。图12显示了通过碘化丙啶的抗OacGD2抗体的直接细胞毒性。专利技术详述在第一方面中，本专利技术涉及特异性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂的抗体或其功能片段，所述抗体包括：a)轻链，其包括具有以下氨基酸序列的三个轻链互补区(CDR)：i)轻链CDR1：QSLLKNNGNTFL(SEQ id n°1)；ii)轻链CDR2：KVS；iii)轻链CDR3：SQSTHIPYT(SEQ id n°2)；和来自免疫球蛋白轻链的轻链框架序列，其中所述框架序列包含人κCL结构域；和b)重链，其包含具有以下氨基酸序列的三个重链互补区(CDR)：i)重链CDR1：EFTFTDYY(SEQ id n°3)；ii)重链CDR2：IRNRANGYTT(SEQ id n°4)；iii)重链CDR3：ARVSNWAFDY(SEQ id n°5)；和来自免疫球蛋白重链的重链框架序列，其中所述框架序列包括：1)来自人IgG1的CH2和CH3结构域，和2)来自人IgG1的CH1结构域，所述CH1结构域经突变以恢复在其他IgG亚类中典型的CH1和轻链之间的IgG配对，或所述CH1结构域由来自非IgG1亚类如人IgG2、IgG3或IgG4的CH1结构域替换。所述抗体具有恢复的针对表达GD2-O-乙酰化神经节苷脂的细胞的促凋亡活性，同时还表现出IgG1特性，如ADCC活性和半衰期。抗体是对应于四聚体的免疫球蛋白分子，其包含四条多肽链，两条同样的重(H)链(全长约50-70kDa)和两条同样的轻(L)链(全长约25kDa)由二硫键相互连接。轻链分类为κ和λ。重链分类为IgG的γ。每条重链由N-端重链可变区(在本文中缩写为HCVR)和重链恒定区组成。重链恒定区由IgG的三个结构域(CH1、CH2和CH3)，以及CH1和CH2结构域之间的铰链结构域组成。每条轻链由N-端轻链可变区(在本文中缩写为LCVR)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。HCVR和LCVR区可以进一步细分成高可变区，称为互补决定区(CDR)，其夹杂着更保守的称为框架区(FR)的区域。每个HCVR和LCVR由从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。每个结构域的氨基酸分配是依照公知的惯例(IMGT，The International Immunogen本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异性结合O‑乙酰化‑GD2神经节苷脂的抗体或其功能片段，所述抗体包括：a)轻链，其包括具有以下氨基酸序列的三个轻链互补区(CDR)：i)轻链CDR1：QSLLKNNGNTFL(SEQ id n°1)；ii)轻链CDR2：KVS；iii)轻链CDR3：SQSTHIPYT(SEQ id n°2)；和来自免疫球蛋白轻链的轻链框架序列，其中所述框架序列包含人κCL结构域；和b)重链，其包含具有以下氨基酸序列的三个重链互补区(CDR)：i)重链CDR1：EFTFTDYY(SEQ id n°3)；ii)重链CDR2：IRNRANGYTT(SEQ id n°4)；iii)重链CDR3：ARVSNWAFDY(SEQ id n°5)；和来自免疫球蛋白重链的重链框架序列，其中所述框架序列包括：1)来自人IgG1的CH2和CH3结构域，和2)来自人IgG1的CH1结构域，所述CH1结构域经突变以恢复在其他IgG亚类中典型的CH1和轻链之间的配对，或所述CH1结构域由来自非IgG1亚类如人IgG2、IgG3或IgG4的CH1结构域替换。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.11.11 EP 13005298.81.一种特异性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂的抗体或其功能片段，所述抗体包括：a)轻链，其包括具有以下氨基酸序列的三个轻链互补区(CDR)：i)轻链CDR1：QSLLKNNGNTFL(SEQ id n°1)；ii)轻链CDR2：KVS；iii)轻链CDR3：SQSTHIPYT(SEQ id n°2)；和来自免疫球蛋白轻链的轻链框架序列，其中所述框架序列包含人κCL结构域；和b)重链，其包含具有以下氨基酸序列的三个重链互补区(CDR)：i)重链CDR1：EFTFTDYY(SEQ id n°3)；ii)重链CDR2：IRNRANGYTT(SEQ id n°4)；iii)重链CDR3：ARVSNWAFDY(SEQ id n°5)；和来自免疫球蛋白重链的重链框架序列，其中所述框架序列包括：1)来自人IgG1的CH2和CH3结构域，和2)来自人IgG1的CH1结构域，所述CH1结构域经突变以恢复在其他IgG亚类中典型的CH1和轻链之间的配对，或所述CH1结构域由来自非IgG1亚类如人IgG2、IgG3或IgG4的CH1结构域替换。2.如权利要求1所述的抗体，其中所述特异性结合O-乙酰化-GD2神经节苷脂的抗体或其功能性片段显示出对于所述神经节苷脂的KD小于2×10-7M。3.如权利要求1或2任一项所述的抗体，其中所述抗体包含具有氨基酸序列SEQ idn°6的轻链可变区(LCVR)和/或具有氨基酸序列SEQ id n°7的重链可变区(HCVR)。4.如权利要求1至3中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含具有序列SEQ id n°8的人κCL结构域。5.如权利要求4所述的抗体，其中所述抗体具有轻链，所述轻链具有氨基酸序列SEQ id n°9。6.如权利要求1至5中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括具有序列SEQ id n°10的来自人IgG1的CH2和CH3结构域。7.如权利要求1至6中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括来自人IgG1的CH1结构域，所述CH1结构域经突变以恢复在其他IgG亚类中典型的CH1和轻链之间的配对，对应于在其序列的第133或134位呈现半胱氨酸残基的来自人IgG1的CH1结构域，如序列SEQ id n°11。8.如权利要求1至6中任一项所述的抗体，其中所述抗体包括来自人IgG3的CH1结构域，如SEQ id n°12。9.如权利要求1至8中任一项所述的抗体，其中所述抗体还包括来自人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的铰链结构域或其衍生物。10.如权利要求9所述的抗体，其中所述铰链结构域选自包括SEQ id n°13至SEQ idn°19的组。11.如权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包括：1)具有氨基酸序列SEQ id n°9的轻链，2)由如下组成的重链：●具有序列SEQ id n°10的来自人IgG1的CH2和CH3结构域，●对应于人CH1的氨基酸序列及选自包含如下的组或由如下所组成的组的铰链结构域：序列抗体图SEQ id n°:20301.14a2SEQ id n°:21301.14b3SEQ id n°:22301.154SEQ id n°:34301.15b9SEQ id n°:23301.165SEQ id n°:24301.176SEQ id n°:25301.187SEQ id n°:26301.198SEQ id n°:31301.2010SEQ id n°:32301.211112.如权利要求11所述的抗体，其中所述抗体是301.14b、301.15、301.18或301.19，优选301.15。13.如权利要求1至12中任一项所述的抗体，其中所述抗体是免疫缀合物。14.一种药物组合物，其包括根据权利要求1至13中任一项所述的至少一种抗体和药学上可接受的载体。15.如权利要求14所述的药物组合物，其中所述组合物用于治疗表达GD2-O-乙酰化神经节苷脂的癌症，如成神经细胞瘤、黑素瘤、成胶质细胞瘤、小细胞肺癌、乳腺癌和癌干细胞癌症。16.一种用于提高如权利要求1-10所公开的特异性结合O-...

【专利技术属性】
技术研发人员：让马可·勒·杜萨尔，米奇卡尔·泰姆，米莱内·多维柳斯，
申请(专利权)人：OGD二药物，南特大学，
类型：发明
国别省市：法国;FR