用于生物学检测的GM1神经节苷脂与膜联蛋白V的微粒多肽比例制造技术

本发明专利技术人描述了一种检测细胞、组织、器官或生物体状态的方法。所述方法包括为来自于所述细胞、组织、器官或生物体的微粒样本建立比例。所述比例是包含GM1神经节苷脂的微粒(其优选地结合至霍乱毒素B(CTB))中的选定多肽(“GM1神经节苷脂微粒多肽”)与包含暴露的磷脂酰丝氨酸的微粒(其优选地结合至膜联蛋白V)中的选定多肽(“膜联蛋白V微粒多肽”)的比例。由此得到的GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例可以指示所述细胞、组织、器官和生物体的状态。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生物学检测的GM1神经节苷脂与膜联蛋白V的微粒多 肽比例
本专利技术涉及医药、细胞生物学、分子生物学和遗传学领域。本专利技术涉及医药领域。 具体地，本专利技术涉及检测细胞、组织、器官或生物体的生理和病理状态的方法。本 专利技术也涉及疾病如癌症的诊断和治疗。 参考美国专利申请 60/713,992、12/065,549、12/065,551、60/878,222、 12/377, 398、61/066, 671、61/227, 865 和 61/257, 121。还参考国际专利申请 PCT/ GB2005/003206、PCT/SG2006/000233、PCT/SG2006/000232、PCT/SG2007/000257 和 PCT/ SG2009/000062。 前述申请，本申请和前述申请中每篇所引用或参考的每篇文献（包括每篇前述申 请的审查过程中申请和文章引用的文献），以及在前述申请和文章中的每篇中及所述 申请和文章引用的文献中所引用或提及的任何产品的任何生产商说明书或目录，均通过引 用的方式纳入本申请。另外，本文所引用的所有文献，本文所引用的文献中所引用或参考的 所有文献，以及本文中或任何通过引用方式纳入本文的文献中所引用或提及的任何产品的 任何生产商的说明书或目录，均通过引用的方式纳入本申请。通过引用纳入本文的文献或 其中的任何教导均可用于本专利技术的实施。通过引用纳入本文的文献不应被认为是现有技 术。
技术介绍
现在普遍认为，微粒是由不同种类的细胞分泌的，并根据所述细胞的细胞类型和 病理生理状态或细胞微环境而不同，如阿尔茨海默病、TB感染、HIV感染、癌症、缺氧、辐射、 氧化应激、切变应力和暴露激活的补体复合体L微粒是膜囊（membrane vesicle)。迄今为 止，存在数种微粒类型，包括外来体（exosome)、核外粒体（ectosome)和凋亡小体 2。这些微 粒含有蛋白质和RNA。许多这类微粒已被证明具有提高生物学活性或发疾的生物学活性。 体液如尿液、血液、眼泪、唾液、支气管肺泡液（bronchoaveolar fluid)、肿瘤渗出 液、附睾液、羊水和乳含有许多膜囊。当脱落时，微粒的类型和生物活性取决于所述细胞种 类、它们的生理状态及它们的细胞微环境，这些微粒是潜在的诊断或预后标志物的良好来 源。耗尽这些微粒也是潜在地治疗性的。然而，体液中许多这类微粒的种类和来源还是未 知的，并且据推测是高度异源的。 因此，本领域中需要可以快速富集这些微粒并且提高基于脂质微粒的生物标记物 或治疗应用的可预测性和稳定性。
技术实现思路
除非另有说明，本专利技术的实施采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和 免疫学的常用技术，这些均在本领域普通技术人员的能力范围内。上述技术在文献 中有说明。参见，例如 J.Sambrook，E. F.Fritsch, and T.Maniatis, 1989, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Second Edition, Booksl-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press ；Ausubel, F. M. et al. (1995and periodic supplements ；Current Protocols in Molecular Biology,ch. 9, 13,andl6,John ffiley&Sons, New York,N. Y. ) ；B. Roe, J. Crabtree,and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing:Essential Techniques, John ffiley&Sons ；J. M. Polak and James 0' D.McGee, 1990, In Situ Hybridization:Principles and Practice ；0xford University Press ；M. J. Gait(Edito r), 1984, Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach, Irl Press ；D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology:DNA Structure Part A:Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press ；Using Antibodies:A Laboratory Manual: Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David Lane,Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN0-87969-544-7) ；Antibodies:A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN0-87969-314-2), 1855. Handbook of Drug Screening,edited by Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes(2001, New York, NY, Marcel Dekker,ISBN〇-8247-〇562-9);及 Lab Ref:A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams and Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN0-87969-630-3。上述普通教科书 (general texts)通过引用的方式纳入本说明书。 【附图说明】 图1为示出血清的按大小分级分离的图。使获自健康个体的血清通过 Sepharose2B分子筛离心柱。将所述柱用PBS冲洗3次。 将获自输入血清、穿过液（flow through)和洗出液（wash)的等分试样通过SDS/ PAGE分离，所得凝胶用银染色（上图）或者电转染到硝酸纤维素上以用抗CD9抗体进行蛋 白质印迹（下图）。 图2为示出CTB亲和色谱法的图。将血清的分子筛色谱法后的穿过液和洗出液级 分合并起来并通过CTB亲和色谱法测试GM1神经节苷脂的存在情况。 将所述级分用生物素化的CTB孵育，然后链霉亲和素-偶联到磁珠上，然后用PBS 洗涤三次。将获自输入血清、穿过液（或未结合的级分）和洗出液的等分试样通过SDS/PAGE 分离，所得凝胶用银染色（上图）或者电转染到硝酸纤维素上以用抗CD9抗体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测细胞、组织、器官或生物体的状态的方法，所述方法包括为来自所述细胞、组织、器官或生物体的微粒样本建立以下的比例：(a)包括GM1神经节苷脂的微粒中的选定多肽，所述微粒优选地结合至霍乱毒素B(CTB)(“GM1神经节苷脂微粒多肽”)；与(b)包括磷脂酰丝氨酸的微粒中的选定多肽，所述微粒优选地结合至膜联蛋白V(“膜联蛋白V微粒多肽”)；其中，所建立的(a)与(b)的比例(“GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例”)可以指示所述细胞、组织、器官或生物体的状态。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.11.30 SG 201108886-1;2012.04.18 SG 201202838-1. 一种检测细胞、组织、器官或生物体的状态的方法，所述方法包括为来自所述细胞、 组织、器官或生物体的微粒样本建立以下的比例： (a) 包括GM1神经节苷脂的微粒中的选定多肽，所述微粒优选地结合至霍乱毒素 B(CTB) ( GM1神经节苷脂微粒多肽）；与 (b) 包括磷脂酰丝氨酸的微粒中的选定多肽，所述微粒优选地结合至膜联蛋白V( 膜 联蛋白V微粒多肽）； 其中，所建立的（a)与（b)的比例（GM1神经节苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽 的比例）可以指示所述细胞、组织、器官或生物体的状态。2. 根据权利要求1的方法，其中所述多肽选自：四次跨膜蛋白（如，GenBank登记 号为 ΝΡ_001760· 1 的 CD9、GenBank 登记号为 ΝΡ_004347· 1 的 CD81、GenBank 登记号为 ΝΡ_001771· 1 的 CD63)、Rab GTP 酶（如，GenBank 登记号为 ΝΡ_004153· 2 的 Rab5a、GenBank登 记号为 ΝΡ_002859· 1 的 Rab5b 和 GenBank 登记号为 ΝΡ_004574· 2 的 Rab5c、GenBank 登记号 为 ΝΡ_004571· 2 的 Rab-27a 和 GenBank 登记号为 ΝΡ_004154· 2 的 Rab-27b、GenBank 登记号 为 ΝΡ_006852· 1 的 Rab35)、LAMP (如，GenBank登记号为 ΝΡ_005552· 3 的 Lampl 和 GenBank 登 记号为NP_002285. 1的Lamp2)、小窝蛋白（如，GenBank登记号为NP_001744. 2的小窝蛋白 l、GenBank登记号为ΝΡ_001224· 1的小窝蛋白2)、GenBank登记号为ΝΡ_001121620· 1的运 铁蛋白受体（TFRC)、GenBank登记号为ΝΡ_001070145· 1的网格蛋白轻链A(CLTA)、GenBank 登记号为NP_001825. 1网格蛋白轻链B(CLTB)、GenBank登记号为NP_004850. 1的网格蛋白 重链 1 (CLTC)、GenBank 登记号为 ΝΡ_006283· 1 的 TsglOl、GenBank 登记号为 ΝΡ_037506· 2 的 Alix、GenBank 登记号为 ΝΡ_000593· 1 的 PAIl、GenBank 登记号为 ΝΡ_002623· 2 的 PLGF、 GenBank 登记号为 ΝΡ_001029124· 1 的原降钙素 、GenBank 登记号为 ΝΡ_006263· 1 的 S-100b、 GenBank 登记号为 ΝΡ_001129071· 1 的 TGFP2(TGFB2)，以及 GenBank 登记号为 ΝΡ_003245· 1 的--ΜΡ1，优选地其中所述多肽包括GenBank登记号ΝΡ_001760. 1的⑶9。3. 根据权利要求1或2的方法，其中所述方法包括选择所述样本中包括GM1神经节苷 脂的微粒，例如通过选择所述样本中结合至霍乱毒素亚基B(CTB)的微粒；或者其中所述方 法包括选择所述样本中包括暴露的磷脂酰丝氨酸的微粒，例如通过选择所述样本中结合至 膜联蛋白V的微粒。4. 根据权利要求1、2或3的方法，其中进一步包括通过尺寸选择微粒的步骤，例如通过 分子筛色谱法，优选地在步骤（a)之前；或者包括建立图谱，所述图谱包括多个GM1神经节 苷脂微粒多肽与膜联蛋白V微粒多肽的比例以用于多个选定的多肽种类，每一比例均指示 所述细胞、组织、器官或生物体的状态。5. 根据前述任一权利要求的方法，其中所述细胞、组织、器官或生物体的状态包括心血 管疾病状态；其中所述多肽包括CD9 ;并且其中与健康状态相比，在心血管疾病中，所述GM1 神经节苷脂微粒CD9多肽与膜联蛋白V CD9微粒多肽的比例较高。6. 根据前述任一权利要求的方法，其中所述细胞、组织、器官或生物体的状态包括慢性 心力衰竭（CHF)疾病状态；其中所述多肽包括CD9 ;并且其中与健康状态相比，在慢性心力 衰竭（CHF)疾病状态中，所述GM1神经节苷脂微粒CD9多肽与膜联蛋白V CD9微粒多肽的比 例较高。7. 根据前述任一权利要求的方法，其中所述细胞、组织、器官或生物体的状态包括急性 心肌缺血（AMI)疾病状态；其中所述多肽包括CD9 ;并且其中与健康状态相比，在急性心肌 缺血（AMI)疾病状态中，所述GM1神经节苷脂微粒CD9多肽与膜联蛋白V...

【专利技术属性】
技术研发人员：林赛娟，陈国贤，
申请(专利权)人：新加坡科技研究局，新加坡保健服务集团有限公司，
类型：发明
国别省市：新加坡;SG