组合的γ9δ2T细胞受体链交换制造技术

本发明专利技术提供鉴定介导抗肿瘤响应的γ9δ2T‑细胞受体(γ9δ2TCR)的方法。令人惊讶的是，现在发现γ9‑T‑细胞受体链和δ2‑T‑细胞受体链(δ2TCR链)的CDR3区很重要。基于这些发现，组合的γδTCR‑链交换(CTE)被提议作为用于鉴定介导抗肿瘤响应的γ9δ2TCR的有效方法。使用本发明专利技术的方法，鉴定出介导抗肿瘤响应的各个γ9TCR和δ2TCR链的特定序列。因此，本发明专利技术进一步提供用于可以例如在癌症诊断或治疗中使用的特定γ9δ2TCR或其片段。本发明专利技术进一步提供可用于表达根据本发明专利技术的γ9δ2TCR的核酸序列、基因构建体和逆转录病毒载体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】组合的γ9δ2Τ细胞受体链交换
本专利技术涉及医学领域。其涉及用于癌症治疗的免疫学和细胞疗法。本专利技术还涉及 用于T细胞受体、特别是可介导抗肿瘤响应的T细胞受体的识别方法。本专利技术还涉及在癌 症治疗中介导抗肿瘤响应的特定T细胞受体及其在癌症治疗中的用途。
技术介绍
到目前为止，异源干细胞移植（allo-SCT)是用于罹患癌症的患者的唯一公认和 被证明疗效的细胞疗法。这由如下观察所证实，即在具有弱风险白血病的患者中长期缓 解可特别采用allo-SCT来实现。然而，治愈以重度毒性的代价进行，导致治疗的患者大约 30%的总死亡率。这阻碍了广泛的临床实施，因为特别是具有低风险癌症的患者可能具有 良好的整体存活率，不能证明这种攻击性疗法（aggressive therapies)的适当性。因此， 最终的目标仍然是非攻击性移植方法的发展。这意味着产生配备有分子特征的细胞产品， 该分子特征允许选择性靶向癌细胞，同时保留健康组织。这将允许对具有医疗需求的大量 患者的治愈性治疗，不论年龄如何。 为了设计移植物（可以是异源的或自体的）以促进例如肿瘤反应性α β T-细胞 的快速生成，已经提出了用编码肿瘤特异性α β T-细胞受体（TCR)或嵌合抗原受体的基因 来重编程α β T-细胞。数种这类受体已经用于在I期临床试验中重定向α β T-细胞。然 而，用规定的α β TCR重编程α β T-细胞基本上因它们对HLA类型的限制而受阻，从而限 制了可以采用一种α β-TCR进行治疗的患者数量。此外，引入的a ^TCR链与内源a ^TCR 链的配对可能诱发危及生命的自体反应。 已经提出了使用Y 9 δ 2Τ-细胞的能力以高亲和性TCR介导选择性抗肿瘤反应来 介导抗肿瘤反应，而忽略健康环境（Fisch等人，1990, Science250,1269-1273)。分离的 Y 9 δ 2T-细胞可有效地杀死血液学恶性肿瘤和实体瘤的肿瘤细胞（Kabelitz等人，2007， Cancer Res. 67, 5-8)。然而，γ9 δ 2Τ-细胞的功能和增殖能力在癌症患者中常常严重受损， 使得自体Υ9 δ 2Τ-细胞对于免疫干预不那么有吸引力。 已经提出了将规定的Υ9 δ 2TCR转移到α βΤ-细胞中，其介导α βΤ-细胞的肿 瘤特异性增殖并且针对肿瘤细胞系的广泛组重定向效应物CD8+和辅助物CD4+a β T-细胞 亚群，而在体外和体内的正常细胞可被忽略（Marcu-Malina等人，2011，Bloodll8,50-59)。 然而，关于Y9 δ 2TCR如何介导针对肿瘤细胞的不同活性以及需要用什么策略来分离对癌 细胞具有高活性的Y9S2TCR，可得的知识极少。 因此，在本领域中存在提供对癌细胞具有高活性的Y 9 δ 2TCR的需求，并且在本 领域中存在提供用于选择这种高度活性的Y 9 δ 2TCR的改进方法的需求。
技术实现思路
本专利技术提供鉴定介导抗肿瘤响应的Y 9 δ 2Τ-细胞受体（Y 9 δ 2TCR)的方法。如 所述，关于Υ9 δ 2TCR介导抗肿瘤反应的分子要求，可得的知识很少。尤其是用于介导抗 肿瘤响应的Υ9 δ 2TCR的互补决定区（CDR)内的变异性的贡献在现有技术中被视为是可 忽略的。令人惊奇的是，现在发现，Υ9Τ-细胞受体链（Y9TCR链）和δ2Τ-细胞受体链 (δ 2TCR链）的⑶R3区是重要的。基于这些发现，组合的γ δ TCR链交换（CTE)被提议 作为用于鉴定介导抗肿瘤响应的Υ9 δ 2TCR的有效方法。在本专利技术的方法中，γ 9Τ-细胞 受体链和δ 2Τ-细胞受体链的⑶R3区被随机修饰和组合，以形成新的γ 9 δ 2TCR。新设计 的Y 9 δ 2TCR被提供并且优选整合到随后在细胞表面表达γ 9 δ 2TCR的T-细胞中。相应 地，确定CTE工程化的T细胞的抗肿瘤响应。以这种方式，可以测试多种组合，并且可以对 每一种组合确定抗肿瘤响应。在确定抗肿瘤响应之后，可鉴定介导高度活性的抗肿瘤响应 的Υ9 δ 2Τ-细胞受体。使用本专利技术的方法，诸如在实施例中所述，已经鉴定了介导与参考 Y9S2TCR G115wt相比抗肿瘤响应增加的数种响应性γ9δ2ΤΟ?。因此，本专利技术进一步提 供可用于例如癌症诊断或治疗中的Υ9 δ 2TCR或其片段。本专利技术进一步提供可用于根据本 专利技术在细胞（优选T细胞）中表达γ9 δ 2TCR的核酸序列、基因构建体和逆转录病毒载体。 【附图说明】 图1 :由Y 9 δ 2TCR介导的抗肿瘤反应性。 用示出的野生型Y9S2TCR或CTE工程化y9S2TCR以病毒方式转导外周血 T-细胞，并且在51Cr-释放测定（E:T3:1)中针对Daudi (A，C)来测试。特异性裂解表示为 在5小时之后在上清液中测量的倍率变化51Cr-释放。当与Y9-G115 wt/S2-G115wt工程 化T-细胞的反应相比较时计算倍率变化。（B，D)在IFN γ ELISA中在指示量的帕米膦酸盐 (pamidronate)的存在下或（E)不同的E:T比率下。（F)Daudi与用指示的γ9 δ 2TCR工程 化改造的T-细胞的细胞-细胞结合物（conjugate)的百分比通过流式细胞仪确定。数据 代表平均值土SD。*ρ〈0· 05, **ρ〈0· 01，***p〈0. 001 (根据单向 AN0VA)。 图2:表达克隆6115的单丙氨酸突变3 2链的转导1'-细胞的^9 3 21'0?表达和 功能亲和力（functional avidity)。 用示出的Y9和δ 2TCR链以病毒方式转导外周血T-细胞，并且（A)使用δ 2-链 特异性抗体通过流式细胞仪进行分析。示出的是与表达S 2-6115#的野生型对照相比在平 均荧光强度（MFI)中的倍率变化。（C)在针对肿瘤靶Daudi (E: TlO :1)的51Cr-释放测定中 测试转导子的裂解活性。特异性裂解表示为在5小时后在上清液中测量的倍率变化 51Cr-释 放。与未突变的野生型（S 2-G115wt)的反应性相比来计算倍率变化。箭头表示削弱受体表 达（虚线箭头）或功能亲和力（实线箭头）的S 2-G115中的突变。（B，D)指示出相关氨 基酸（箭头）的Y 9 δ 2TCR Gl 15的晶体结构。 图3 :表达具有δ 2-CDR3长度突变的γ9 δ 2TCR G115的转导T-细胞的γ9 δ 2TCR 表达和功能亲和力。 (A)使用γ δ TCR-pan抗体通过流式细胞仪分析所示转导子的Y 9 δ 2TCR表达。示 出的是与表达S 2-6115#的野生型对照相比的在平均荧光强度（MFI)中的倍率变化。（B) 针对肿瘤靶Daudi (Ε :T1 :1)的δ 2-G115m转导T-细胞的IFN γ分泌在100 μ M帕米膦酸盐 的存在下在孵育24h后通过ELISA测量。示出的是当与表达wt δ 2-G115wt的转导子的反应 性相比时在IFN γ产生中的倍率变化。（C)如所指示的，在滴定测定中针对肿瘤靶Daudi，在 增加的帕米膦酸盐的量下，对表达S 2-6115_^412的转导子进行测试。I本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴定介导抗肿瘤响应的γ9δ2T‑细胞受体的方法，包括以下步骤：a)提供T‑细胞；b)提供包括γ9‑CDR3编码区的编码γ9‑T‑细胞受体链的核酸序列和包括δ2‑CDR3编码区的编码δ2‑T‑细胞受体链的核酸序列，其中所述γ9‑CDR3编码区被随机修饰，其中所述δ2‑CDR3编码区被随机修饰；c)将步骤b)的核酸序列引入到T‑细胞中，以提供具有包括步骤b)的γ9‑T‑细胞受体链和步骤b)的δ2‑T‑细胞受体链的γ9δ2T‑细胞受体的工程化T‑细胞；d)任选地，重复步骤b)和c)；e)确定在步骤c)和d)中提供的工程化T‑细胞的抗肿瘤响应；f)鉴定介导抗肿瘤响应的工程化T‑细胞的γ9δ2T‑细胞受体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.03.28 US 61/616,440;2012.09.21 US 61/703,7881. 一种用于鉴定介导抗肿瘤响应的Y9S2T-细胞受体的方法，包括以下步骤： a) 提供T-细胞； b) 提供包括Y9-⑶R3编码区的编码Y9-T-细胞受体链的核酸序列和包括S2-⑶R3 编码区的编码S2-T-细胞受体链的核酸序列，其中所述Y9-CDR3编码区被随机修饰，其中 所述S 2-⑶R3编码区被随机修饰； c) 将步骤b)的核酸序列引入到T-细胞中，以提供具有包括步骤b)的Y9-T-细胞受 体链和步骤b)的S 2-T-细胞受体链的y 9 S 2T-细胞受体的工程化T-细胞； d) 任选地，重复步骤b)和c); e) 确定在步骤c)和d)中提供的工程化T-细胞的抗肿瘤响应； f) 鉴定介导抗肿瘤响应的工程化T-细胞的y 9 S 2T-细胞受体。2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述编码Y9-T-细胞受体链的核酸序列编码与 SEQ ID NO. 1的氨基酸序列具有至少60%序列同一性的氨基酸序列，和/或其中所述编码 S 2-T-细胞受体链的核酸序列编码与SEQ ID NO. 2的氨基酸序列具有至少60%序列同一 性的氨基酸序列。3. 根据权利要求1-2中任一项所述的方法，其中所述被随机修饰的Y9-CDR3编码区在 与SEQ ID NO. 1的氨基酸残基122-124对应的氨基酸序列处被修饰。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述被随机修饰的S2-CDR3编码区在 与SEQ ID NO. 2的氨基酸残基115-122对应的氨基酸序列处被修饰。5. 根据权利要求4所述的方法，其中随机修饰与S2-CDR3编码区对应的氨基酸序列包 括长度上的修饰。6. 根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中随机修饰氨基酸序列包括引入氨基酸 替换、缺失和/或插入。7. 根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述编码Y9-T-细胞受体链的核酸序 列在表达载体中提供，且所述编码S 2-T-细胞受体链的核酸序列在表达载体中提供，或其 中所述编码Y9-T-细胞受体链的核酸序列和所述编码S2-T-细胞受体链的核酸序列在单 个表达载体中提供。8. 根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述编码Y9-T-细胞受体链的核酸序 列在逆转录病毒载体中提供，且所述编码S 2-T-细胞受体链的核酸序列在逆转录病毒载 体中提供，或其中所述编码Y9-T-细胞受体链的核酸序列和所述编码S2-T-细胞受体链 的核酸序列在单个逆转录病毒载体中提供，且其中将核酸序列引入到T-细胞中的步骤包 括T-细胞的逆转录病毒载体转导。9. 根据权利要求1-8中任何一项所述的方法，其中确定抗肿瘤响应的步骤包括将所述 工程化T-细胞与肿瘤细胞接触，和测量其裂解所述肿瘤细胞和/或诱导IFN- Y的能力。10. -种Y 9 S 2T-细胞受体或其片段，包括具有Y 9-⑶R3区的y 9-T-细胞受体链和 具有S 2-CDR3区的S 2-T-细胞受体链，其中所述Y9-CDR3区的与SEQ ID NO. 1的氨基酸 残基122-124对应的氨基酸序列被修饰，其中所述S 2-⑶R3区的与SEQ ID NO. 2的氨基酸 残基115-122对应的氨基酸序列被修饰，其中在所述y9 S 2T-细胞受体或其片段内的氨基 酸修饰的组合如在表1中所列出。11. 一种Y9S2T-细胞受体或其片段，包括： 包括Y 9-⑶R3区的y 9-T-细胞受体链和包括S 2-⑶R3区的S 2-T-细胞受体链，其 中所述Y 9-⑶R3区的与SEQ ID NO. 1的氨基酸序列的氨基酸残基122-124对应的氨基酸 序列是AQQ，其中所述S2-CDR3区的与SEQ ID NO. 2的氨基酸序列的氨基酸残基115-122 对应的氨基酸序列是ALKRTD。12. 根据权利要求10-11中任一项所述的Y9S2T-细胞受体或...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·H·E·库巴尔，EC·格林德尔，
申请(专利权)人：UMC乌得勒支控股有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL