扩展真核生物遗传密码制造技术

本发明专利技术是扩展真核生物遗传密码。提供了生产翻译组件的组合物和方法，该组件扩展了在真核细胞中遗传编码氨基酸的数量。组件包括正交tRNA、正交氨酰基-tRNA合成酶，tRNA/合成酶的正交对和非天然氨基酸。也提供了在真核细胞中用非天然氨基酸生产蛋白质的蛋白质和方法。（*该技术在2024年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于真核细胞中的翻译生物化学领域。本专利技术涉及在真核细胞中生产和组合正交tRNA、正交合成酶和它们配对的方法。本专利技术也涉及非天然氨基酸的组合物、蛋白质和在真核细胞中生产包括非天然氨基酸的蛋白质的方法。
技术介绍
从细菌到人类，每个已知生物的遗传密码都编码了相同的二十个普通氨基酸。这20个相同的天然氨基酸的不同组合构成蛋白质，进行实际上所有的复杂生命过程，从光合作用到信号转导和免疫反应。为了研究和修饰蛋白的结构和功能，科学家们试图操纵遗传密码和蛋白质的氨基酸序列。但是，难以去除由遗传密码强加的限制，即将蛋白质限于二十个遗传编码的标准构建(除了罕用的硒代半胱氨酸(参见，例如，A.Bock等，(1991)，Molecular Microbiology5:515-20)和卩比咯赖氨酸(参见，例如，G.Srinivasan,等，(2002)，Science296:1459-62)。 在消除这些限制方面已经取得了一些进展，虽然该进展已被限制而且合理控制蛋白结构和功能的能力仍就处于萌芽状态。例如，化学家已经开发了合成和操纵小分子结构的方法和策略(参见，例如，E.J.Corey和X.-M.Cheng，化学合成的逻辑(The Logicof Chemical Synthesis)(ffiIey-1nterscience, New York,1995))。全合成(参见，例如，B.Merrifield, (1986)，Science232:341-7 (1986))和半合成方法(参见，例如，D.Y.Jackson 等，(1994) Science266:243-7 和 P.E.Dawson 和 S.B.Kent, (2000)，AnnualReview of Biochemistry69:923-60)使合成肽和小蛋白成为可能,但是这些方法的使用在超过10千道尔顿(kDa)的蛋白质中受到限制。诱变法虽然是强大的，但也限于有限数量的结构改变。在很多情况下，可能在整个蛋白质中竞争性掺入与普通氨基酸接近的结构类似物。参见，例如，R.Furter, (1998),ProteinScience7:419-26 ;Κ.Kirshenbaum,等，(2002),ChemBioChem3:235-7 和 V.Doring 等，(2001)，Science292:501_4。在尝试扩展操纵蛋白结构和功能的能力中，开发了用化学酰化正交tRNA的体外方法，该方法允许在体外响应于无义密码子将非天然氨基酸选择性掺入(参见，例如，J.A.Ellman,等，(1992), Science255:197-200)。将具有新结构和物理性质的氨基酸选择性掺入蛋白中，以研究蛋白折叠和稳定性，以及生物分子识别和催化作用。参见，例如，D.Mendel,等，(1995), Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure24:435-462 和 V.W.Cornish,等(1995 年 3 月 31 日)，Angew Chem.1nt.Ed.Engl.，34:621_633。然而，该方法的化学计量性质严重限制了可以产生的蛋白量。将非天然氨基酸显微注射入细胞。例如，通过显微注射化学错酰化嗜热四膜虫tRNA(例如，M.E.Saks,等(1996)，用于通过无义抑制将非天然氨基酸体内掺入蛋白质中的工程四膜虫tRNAGln，J.Biol.Chem.271:23169-23175)和相应的mRNA将非天然氨基酸引入爪蟾卵母细胞的烟酰乙酰胆碱受体中(例如，M.W.Nowak,等(1998)，将非天然氨基酸体内掺入爪蟾卵母细胞表达系统的离子通道中，酶学方法.293 =504-529)。这允许通过引入含有物理或化学性质独特的侧链氨基酸，对卵母细胞内的受体进行详细的生物物理研究。参见，例如，D.A.Dougherty (2000),作为蛋白结构和功能探针的非天然氨基酸，Curr.0pin.Chem.Biol.4:645_652。不幸的是，该方法限于可显微注射的细胞中的蛋白质，因为相关的tRNA是体外化学酰化的，不能再酰化，所以蛋白产率很低。为克服这些限制，将新组分加入原核生物大肠杆菌的蛋白生物合成机器中(例如，L.Wang，等，(2001)，Science292:498-500)，这允许在体内遗传编码非天然氨基酸。为响应琥珀密码子TAG，用该方法将具有新化学、物理或生物学性质的一些新氨基酸，包括光亲和标记和可光致异构的氨基酸、酮基氨基酸和糖基化氨基酸以高保真度有效掺入大肠杆菌的蛋白中。参见，例如，J.W.Chin 等，(2002), Journal of the American ChemicalSocietyl24:9026-9027 ；J.ff.Chin 和 P.G.Schultz, (2002)，ChemBioChemll:1135-1137 ；J.ff.Chin,等，(2002), PNAS United States of America99:11020-11024:和 L.Wang 和P.G.Schultz, (2002), Chem.Comm., 1_10。然而,原核细胞和真核细胞的翻译机器并不是高度保守的；因此，加入大肠杆菌的生物合成机器的组分不能经常用来将非天然氨基酸位点特异性地掺入真核细胞的蛋白中。例如，大肠杆菌中使用的詹氏甲烷球菌酪氨酰-tRNA合成酶/tRNA对在真核细胞中是不正交的。此外，tRNA在真核细胞中，而非在原核细胞中的转录是通过RNA聚合酶III进行的，这限制了可在真核细胞中转录的tRNA结构基因的一级序列。而且，与原核细胞相反，真核细胞中的tRNA需要从转录它们的细胞核中输出至胞质，以在翻译中起作用。最后，真核80S核糖体与70S原核核糖体不同。因此，需要开发改进的生物合成机器组件，以扩展真核生物遗传密码。本专利技术满足了这些和其它需要，这在下面公开的综述中显而易见。专利技术概要本专利技术提供了具有翻译组件的真核细胞，例如，正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)对和正交tRNA (O-tRNA)，及它们的个别组件，它们用于真核蛋白生物合成机器，在真核细胞中将非天然氨基酸掺入生长的多肽链中。本专利技术组合物包括含有正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)(例如，来源于非真核生物，如大肠杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌等)的真核细胞(例如，酵母细胞(如酿酒酵母细胞)，哺乳动物细胞、植物细胞、藻类细胞、真菌细胞、昆虫细胞等)，其中O-RS在真核细胞中优选地氨酰化具有至少一个非天然氨基酸的正交tRNA (O-tRNA)。任选地，在给定真核细胞中可以氨酰化两种或多种OtRNA。在一个方面，O-RS氨酰化例如，至少40%、至少45%、至少50%、至少60%、至少75%、至少80%、或甚至90%或更多的具有非天然氨基酸的Ο-tRNA，与具有氨基酸序列，如SEQ ID N0.:86或45中所列序列的O-RS—样有效。在一个实施方式中，本专利技术的O-RS氨酰化具有非天然氨基酸的Ο-tRNA，比O-RS氨酰化具有天然氨基酸的O-tRNA的效率高例如，至少10倍、至少20倍、至少30倍等。在一个实施方式中，SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含有正交氨酰基?tRNA合成酶(O?RS)的真核细胞，其中，O?RS在真核细胞中优选地氨酰化带有至少一个非天然氨基酸的正交tRNA(O?tRNA)。

【技术特征摘要】
2003.04.17 US 60/463,869;2003.06.18 US 60/479,9311.一种含有正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的真核细胞，其中，O-RS在真核细胞中优选地氨酰化带有至少一个非天然氨基酸的正交tRNA (Ο-tRNA)。2.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，O-RS氨酰化具有至少一个非天然氨基酸的Ο-tRNA的效率至少相当于具有SEQ ID N0.:86中所列氨基酸序列的O-RS的50%。3.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述至少一个非天然氨基酸包括两种或多种非天然氨基酸。4.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述O-RS或其部分由SEQID N0.:3_19中任一所列多核苷酸序列或它们的互补多核苷酸序列编码。5.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述O-RS包含SEQID N0.:36-47或86中所列氨基酸序列或它们的保守变异。6.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述O-RS氨酰化具有至少一个非天然氨基酸的Ο-tRNA比O-RS氨酰化具有天然氨基酸的Ο-tRNA至少更有效10倍。7.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述O-RS包含与天然产生的酪氨酰氨酰基-tRNA合成酶(TyrRS)的氨基酸序列至少90%相同的氨基酸序列，并包含两种或多种选自下组的氨基酸: A)与大肠杆菌TyrRS的Tyr37相对应位置上的缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或苏氨酸； B)与大肠杆菌TyrRS的Aspl82相对应位置上的苏氨酸、丝氨酸、精氨酸或甘氨酸； D)与大肠杆菌TyrRS的Phel83相对应位置上的甲硫氨酸或酪氨酸；和 E)与大肠杆菌TyrRS的Leul86相对应位置上的丝氨酸或丙氨酸。8.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述O-RS来自非真核生物。9.如权利要求8所述的细胞，其特征在于，所述非真核生物是大肠杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌。10.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，所述真核细胞是酵母细胞、哺乳动物细胞、植物细胞、藻类细胞、真菌细胞或昆虫细胞。11.如权利要求10所述的细胞，其特征在于，所述细胞是酿酒酵母细胞。12.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，与天然氨基酸相比，所述O-RS对于至少一个非天然氨基酸具有一种或多种改进或增强的酶性质，该性质选自:较高Km、较低Km、较高krat、较低 kMt、较低 kcat/km、较高 kcat/km013.如权利要求1所述的细胞，其中，所述至少一个非天然氨基酸选自:对-乙酰基-L-苯丙氨酸、对-碘代-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、对-炔丙基氧基苯丙氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、0-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAc β -丝氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对-叠氮基-L-苯丙氨酸、对-酰基-L-苯丙氨酸、对-苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对-溴苯丙氨酸、对-氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、酪氨酸氨基酸的非天然类似物；谷氨酰胺氨基酸的非天然类似物；苯丙氨酸氨基酸的非天然类似物；丝氨酸氨基酸的非天然类似物；苏氨酸氨基酸的非天然类似物；烷基、芳基、酰基、叠氮基、氰基、卤素、肼、酰肼、羟基、链烯基、炔基、醚、硫醇、磺酰基、硒、酯、硫代酸、硼酸、硼酸盐、磷酰基、膦酰基、膦、 杂环、烯酮、亚胺、醛、羟胺、酮基或氨基取代的氨基酸或它们的任意组合；具有可光敏化的交联剂的氨基酸；自旋标记的氨基酸；荧光氨基酸；金属结合氨基酸；含金属的氨基酸；放射性氨基酸；光笼蔽和/或可光致异构的氨基酸；含有生物素或生物素-类似物的氨基酸；含酮氨基酸；含有聚乙二醇或聚醚的氨基酸；重原子取代的氨基酸；可化学切割或可光切割的氨基酸；具有延长侧链的氨基酸；含有毒基团的氨基酸；糖取代的氨基酸；含有碳-连接糖的氨基酸；具有氧化还原活性的氨基酸；含α -羟基的酸；氨基硫代酸；α，α双取代的氨基酸；β -氨基酸；除脯氨酸或组氨酸外的环氨基酸，除苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸外的芳族氨基酸。14.如权利要求1所述的细胞，其特征在于，还包含至少一个非天然氨基酸。15.如权利要求1所述的细胞，还包含正交tRNA(O-tRNA)，其特征在于，O-tRNA识别选择密码子并优选地由O-RS氨酰化具有至少一个非天然氨基酸。16.如权利要求15所述的细胞，其特征在于，所述O-tRNA来自下组的生物非真核生物。17.如权利要求16所述的细胞，其特征在于，所述非真核生物是大肠杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌。18.如权利要求15所述的细胞，其特征在于，所述O-tRNA介导将至少一个非天然氨基酸掺入蛋白质，其效率相当于细胞加工包含SEQ ID N0.:65中所列多核苷酸序列的核酸而产生tRNA效率的至少50%。19.如权利要求15所述的细胞，其特征在于，所述O-tRNA在细胞中通过细胞加工与SEQID N0.:65相对应的核酸产生，所述O-RS包含选自下组的多肽序列:SEQ ID N0.=36-47,86和它们的保守变异。20.如权利要求15所述的细胞，还包含含有编码感兴趣多肽的多核苷酸的核酸，其中所述多核苷酸含有O-tRNA识别的选择密码子。21.如权利要求20所述的细胞，其特征在于，含有至少一个非天然氨基酸的感兴趣多肽的产率是从多核苷酸缺少选择密码子的细胞获得感兴趣的天然产生多肽产率的至少5%感兴趣多妝。22.如权利要求20所述的细胞，其特征在于，所述细胞在没有至少一种非天然氨基酸的情况下产生感兴趣多肽的产率是至少一种非天然氨基酸存在下多肽产率的小于30%。23.如权利要求22所述的细胞，其特征在于，所述在没有至少一种非天然氨基酸的情况下生产感兴趣多肽的产率是至少一种非天然氨基酸存在下多肽产率的小于5%。24.如权利要求20所述的细胞，其特征在于，所述感兴趣多肽包括治疗蛋白、诊断蛋白、工业酶或其部分。25.如权利要求24所述的细胞，其特征在于，所述感兴趣多肽包括选自:细胞因子、生长因子、生长因子受体、干扰素、白介素、炎症分子、癌基因产物、肽激素、信号转导分子、甾类激素受体、促红细胞生成素(EPO)、胰岛素、人生长激素、α-1抗胰蛋白酶、血管生成抑制素、抗溶血因子、抗体、载脂蛋白、脱辅蛋白质、心钠素、心房钠尿多肽、心房肽、C-X-C趋化因子、Τ39765、NAP-2、ΕΝΑ-78、Gro_a、Gro_b、Gro_c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-U PF4、MIG、降钙素、c-kit配体、细胞因子、CC趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白_2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎症蛋白-1a、单核细胞炎症蛋白-1β、RANTES, 1309、R83915、R91733、HCC1、Τ58847、D31065、Τ64262、CD40、CD40 配体、C-kit 配体、胶原、集落刺激因子(CSF)、补体因子5a、补体抑制剂、补体受体1、细胞因子、DHFR、上皮嗜中性粒细胞激活肽-78、GROa/MGSA、GRO β , GRO y , MIP-1 α、ΜΙΡ_1 δ、MCP-1、表皮生长因子(EGF)、上皮嗜中性粒细胞激活肽、促红细胞生成素(EPO)、剥脱性毒素、因子IX、因子VI1、因子VII1、因子X、成纤维细胞生长因子(FGF)、纤维蛋白原、纤连蛋白、G-CSF、GM-CSF、葡糖脑苷脂酶、促性腺素、生长因子、生长因子受体、Hedgehog蛋白、血红蛋白、肝细胞生长因子(HGF)、水蛭素、人血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受体、LFA-1、LFA-1受体、胰岛素、胰岛素-样生长因子(IGF)、IGF-1、IGF-11、干扰素、IFN-a、IFN-β、IFN-Y、白介素、IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL_8、IL_9、IL-10、IL-1U IL-12、角质形成细胞生长因子(KGF)、乳铁蛋白、白血病抑制因子、荧光素酶、Neurturin、嗜中性粒细胞抑制因子(NIF)、制瘤素Μ、成骨蛋白、癌基因产物、甲状旁腺激素、PD-ECSF、H)GF、肽激素、人生长激素、多效营养因子、蛋白A、蛋白G、热源性外毒素A、B或C、松弛素、肾素、SCF、可溶性补体受体1、可溶性1-CAM1、可溶性白介素受体、可溶性TNF受体、生长调节素、促生长素抑制素、促生长素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、SEA、SEB、SECU SEC2、SEC3、SED、SEE、留类激素受体、超氧化物歧化酶(S0D)、中毒性休克综合征毒素、胸腺素α 1、组织纤溶酶原激活物、肿瘤生长因子(TGF)、TGF-a、TGF-β、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管内皮生长因子(VEGEF)、尿激酶、Mos、Ras、Raf、Met ；卩53、1&1:、？08、]\^0、扣11、]\^13、1^1、雌激素受体、孕酮受体、睾酮受体、醛固酮受体、0^受体、SCF/c-Kit、CD40L/CD40、VLA-4/VCAM-l、ICAM-1/LFA-1、透明质酸苷 /CD44 和皮质酮的蛋白或蛋白的一部分。26.如权利要求20所述的细胞，其特征在于，还包含由所述核酸编码的感兴趣多肽或其部分。27.如权利要求20所述的细胞，其特征在于，所述感兴趣多肽包含转录调节蛋白或其部分。28.如权利要求27所述的细胞，其特征在于，所述转录调节蛋白是转录激活蛋白。29.如权利要求28所述的细胞，其特征在于，转录激活蛋白是GAL4。30.如权利要求27所述的细胞，其特征在于，所述转录调节蛋白是转录抑制蛋白。31.一种真核细胞，它包含正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)、正交tRNA (O-tRNA)、非天然氨基酸和含有编码感兴趣多肽的多核苷酸的核酸，其中所述多核苷酸含有O-tRNA识别的选择密码子，其中O-RS在真核细胞中优选地氨酰化具有非天然氨基酸的正交tRNA (O-tRNA)，其中所述细胞在没有非天然氨基酸的情况下产生感兴趣多肽的产率是在非天然氨基酸存在下多肽产率的小于30%。32.—种真核细胞，它包含正交tRNA (O-tRNA)，其中所述O-tRNA介导将非天然氨基酸掺入蛋白质，该蛋白质由含有在体内O-tRNA识别的选择密码子的多核苷酸编码。33.如权利要求32所述的细胞，其特征在于，所述O-tRNA介导非天然氨基酸掺入蛋白质中，其效率相当于与由细胞加工包含SEQ ID N0.:65中所列序列的多核苷酸而产生的tRNA效率的至少50%。34.如权利要求32所述的细胞，其特征在于，所述O-tRNA包含SEQID N0.:65中所列多核苷酸序列、其细胞加工形式或它们的保守变异。35.如权利要求32所述的细胞，其特征在于，所述O-tRNA是转录后修饰的。36.编码权利要求32所述的O-tRNA或其互补多核苷酸的核酸。37.如权利要求36所述的核酸，其特征在于，所述核酸含有A框和B框。38.一种在真核细胞中包含GAL4蛋白或其部分的组合物，其中所述GAL4蛋白或其部分含有至少一个非天然氨基酸。39.一种包含蛋白的组合物，其中所述蛋白包含至少一个含有至少一个翻译后修饰的非天然氨基酸，其中所述至少一个翻译后修饰包含一个糖部分。40.如权利要求39所述的组合物，其特征在于，所述至少一个非天然氨基酸是酮基非天然氨基酸。41.如权利要求39所述的组合物，其特征在于，所述至少一个翻译后修饰是在体内真核细胞中进行的。42.一种包含蛋白的组合物，其中所述蛋白包含至少一个非天然氨基酸和至少一个由真核细胞在体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰不是由原核细胞天然进行的。43.如权利要求42所述的组合物，其特征在于，所述翻译后修饰包括通过GlcNAc-天冬酰胺连接将寡糖附着到天冬酰胺上。44.如权利要求43所述的组合物,其特征在于,所述寡糖是(GlcNAc-Man)2-Man-GlcNAc-GlcNAco45.如权利要求42所述的组合物，其特征在于，所述翻译后修饰包括通过GalNAc-丝氨酸、GalNAc-苏氨酸、GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸连接将寡糖附着到丝氨酸或苏氨酸上。46.如权利要求45所述的组合物，其特征在于，所述寡糖包括Gal-GalNAc或Gal-GlcNAc。47.如权利要求4 2所述的组合物，其特征在于，所述翻译后修饰选自:乙酰化、酰化、月旨质-修饰、棕榈酰化、棕榈酸酯加成、磷酸化和糖脂-连接修饰。48.如权利要求42所述的组合物，其特征在于，所述蛋白含有与治疗蛋白、诊断蛋白、工业酶或其部分的序列至少75%相同的氨基酸序列。49.如权利要求48所述的组合物，其特征在于，至少一种，但少于全部的具体氨基酸被非天然氨基酸取代，该具体氨基酸存在于天然产生型的蛋白中。50.如权利要求42所述的组合物，其特征在于，所述蛋白含有至少两个非天然氨基酸。51.如权利要求50所述的组合物，其特征在于，所述蛋白含有至少两个不同的非天然氨基酸。52.如权利要求42所述的组合物，其特征在于，所述蛋白含有至少三个非天然氨基酸。53.如权利要求42所述的组合物，其特征在于，所述蛋白含有四个或更多非天然氨基酸。54.如权利要求42所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂。55.如权利要求42所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含至少100微克蛋白质。56.如权利要求42所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含至少50微克/升的蛋白。57.如权利要求42所述的组合物，其特征在于，所述蛋白含有分泌或定位序列、表位标记、FLAG标记、聚组氨酸标记或GST融合蛋白。58.—种多肽,它选自:(a)包含SEQID N0.:36-47或86中任一所不氨基酸序列的多肽； (b)包含由SEQID N0.:3-19中任一所示多核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽； (c)与(a)或(b)的多肽的特异性抗体发生特异性免疫反应的多肽； (d)包含与天然产生的酪氨酰氨酰基-tRNA合成酶(TyrRS)的序列至少90%相同的氨基酸序列并含有两个或多个选自下组的氨基酸的多肽:与大肠杆菌TyrRS的Tyr37相对应位置上的缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或苏氨酸；与大肠杆菌TyrRS的Aspl82相对应位置上的苏氨酸、丝氨酸、精氨酸或甘氨酸；与大肠杆菌TyrRS的Phel83相对应位置上的甲硫氨酸或酪氨酸；和与大肠杆菌TyrRS的Leul86相对应位置上的丝氨酸或丙氨酸； (e)包含SEQID N0.:36-47或86中至少20个连续氨基酸和两个或多个选自下组的氨基酸取代的多肽:与大肠杆菌TyrRS的Tyr37相对应位置上的缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或苏氨酸；与大肠杆菌TyrRS的Aspl82相对应位置上的苏氨酸、丝氨酸、精氨酸或甘氨酸；与大肠杆菌TyrRS的Phel83相对应位置上的甲硫氨酸或酪氨酸；和与大肠杆菌TyrRS的Leul86相对应位置上的丝氨酸或丙氨酸,其中氨基酸编号方式与大肠杆菌TyrRS的编号方式一致；和， (f)包含(a)、(b)、(c)、⑷或(e)的保守变异的氨基酸序列。59.—种包含权利要求58所述的多肽和赋形剂的组合物。60.一种与权利要求58所述的多肽特异地免疫反应的抗体或抗血清。61.—种多核苷酸,它选自: (a)包括SEQID N0.:3_19或64-85中任一所列的核苷酸序列的多核苷酸； (b)与(a)的多核苷酸序列互补或编码(a)的多核苷酸序列的多核苷酸； (c)编码含有SEQID N0.:36-47或86中所列氨基酸序列或其保守变异的多肽的多核苷酸； (d)编码权利要求58所述多肽的多核苷酸； (e)基本上以全长核酸与(a)、(b)、(c)或(d)的多核苷酸在高度严谨条件下杂交的核酸； (f)编码多肽的多核苷酸，所述多肽包含与天然产生的酪氨酰氨酰基-tRNA合成酶(TyrRS)的序列至少90%相同的氨基酸序列并含有两个或多个选自下组的突变:与大肠杆菌TyrRS的Tyr37相对应位置 上的缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或苏氨酸；与大肠杆菌TyrRS的Aspl82相对应位置上的苏氨酸、丝氨酸、精氨酸或甘氨酸；与大肠杆菌TyrRS的Phel83相对应位置上的甲硫氨酸或酪氨酸；和与大肠杆菌TyrRS的Leul86相对应位置上的丝氨酸或丙氨酸； (g)与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)的多核苷酸至少98%相同的多核苷酸;和， (h)包含(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)的保守变异的多核苷酸。62.—种包含权利要求61所述的多核苷酸的载体。63.如权利要求62所述的载体，其特征在于，所述载体包括质粒、粘粒、噬菌体或病毒。64.如权利要求62所述的载体，其特征在于，所述载体是表达载体。65.—种包含权利要求62所述载体的细胞。66.一种生产在真核细胞中优选氨酰化具有非天然氨基酸的正交tRNA的正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法，该方法包括:(a)将第一种类真核细胞群体在非天然氨基酸存在下进行正选择，其中真核细胞各包括:i)氨酰基-tRNA合成酶(RS)文库的一员，ii)正交tRNA (O-tRNA)，iii)编码正选择标记的多核苷酸，和iv)编码负选择标记的多核苷酸；其中正选择中存活的细胞包含在非天然氨基酸存在下氨酰化正交tRNA (O-tRNA)的活性RS ;和， (b)将正选择中存活的细胞在没有非天然氨基酸的情况下进行负选择，以清除氨酰化具有天然氨基酸的O-tRNA的活性RS，从而提供了优选地氨酰化具有非天然氨基酸的O-tRNA 的 O-RS。67.如权利要求66所述的方法，其特征在于，所述编码正选择标记的多核苷酸可操作地连接于效应元件，细胞还包含:a)编码从效应元件调节转录的转录调节蛋白和b)包含至少一个选择密码子的多核苷酸； 其特征还在于，通过氨酰化具有非天然氨基酸的O-tRNA将非天然氨基酸掺入转录调节蛋白中，导致正选择标记的转录。68.如权利要求67所...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·W·钦，A·T·克罗普，C·安德森，P·G·舒尔茨，
申请(专利权)人：斯克利普斯研究院，
类型：发明
国别省市：