胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建制造技术

本发明专利技术涉及一种生物技术，具体是胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建。它是按如下步序操作：(1)质粒的转化；(2)质粒的消化纯化；(3)目的基因和载体的克隆；(4)重组质粒的包装；(5)重组质粒的鉴定；(6)病毒滴度测定；(7)干细胞培养；(8)病毒感染干细胞；(9)转基因干细胞鉴定；(10)转基因干细胞的目的蛋白含量测定；(11)转基因干细胞生物活性检测。本发明专利技术构建的转基因胚胎神经干细胞不仅对多巴胺能神经元具有很强的促存活作用，而且还保留了原来的神经干细胞的特性。本发明专利技术不仅对运动神经元损伤性疾病，也对神经元变性性疾病的具有很好的治疗作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物技术，特别是一种胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建。
技术介绍
1988年，Rousselet等发现神经胶质细胞的条件培养液具有神经营养作用，1993年美国华裔科学家Lin等从神经胶质瘤细胞条件培养液中纯化了这种具有神经营养作用的蛋白质，克隆其基因并将之命名为胶质细胞源生神经营养因子(glial cellline-derived neurotrophic factor, GDNF)。随后的大量研究表明，GDNF不仅对多巴胺能神经元具有很强的促存活作用，而且对运动神经元、去甲肾上腺素神经元、外周感觉神经元和交感神经元都有很强的促存活作用；而且GDNF对发育中的运动神经元也有良好的营养作用。GDNF对运动神经元的作用在迄今发现的所有神经营养因子中是活性最强的一个，可以促进运动神经元的存活、分化及代谢功能，对胚胎期或出生后损伤的运动神经元都有很强的修复作用。GDNF的这种对运动神经元所具有的修复损伤作用，为运动神经元性疾病(如脊髓损伤)的治疗开辟了新途 径。然而，⑶NF是一种生物大分子，难以通过血脑屏障，因而很难直接转移到中枢神经系统。此外尽管GDNF在哺乳动物体内分布较广，但其含量甚微，因此我们利用基因工程的方法以期获得高产量的活性因子用于脊髓损伤的治疗。长期以来，许多神经系统疾病如脊髓损伤、帕金森氏综合症、脊髓侧束硬化症等的治疗是临床攻克的难题。应用细胞因子直接注射(一次性治疗)或神经组织移植(细胞替换)疗效有限，且一些神经遗传性疾病以及需合适微环境的神经再生的治疗，仅用细胞介导疗法很难达到理想的效果。因此人们想通过基因治疗来解决这些问题。然而体内基因治疗(in vivo)存在某些缺陷，如携带外源基因的载体很难特异性靶向神经细胞或组织区域，而且也不能替换死亡的神经元。间接体内基因疗法(ex vivo)虽已应用于脊髓损伤的移植治疗，但是载体细胞的选择较为困难。作为中枢神经系统基因治疗的载体细胞应当符合下例条件:①易于获取和增殖，包括许多已建株的细胞和胚胎及新生期幼稚细胞载体细胞经转基因处理后移植到脊髓内仍能具有成活和分裂能力载体细胞在脊髓内不能造成浸润生长，以免局部成为轴突生长的障碍，甚至形成肿瘤；④载体细胞在体内应能长期持续表达所携带的目的基因；⑤免疫原性小；⑥载体细胞能自身分泌某些营养物质如细胞外基质最为重要的是载体细胞或其衍生的细胞能替换死亡的神经元或能使已脱髓鞘的轴突重新髓鞘化。近年研究提示,神经干细胞(neural stem cells, NSCs)不仅可在体外大量扩增，而且回输到体内可以长期存活、适当整合于中枢神经组织且可分化成神经元、少突胶质细胞和星型胶质细胞能并稳定表达外源基因，因此是一种理想的载体细胞。尽管NSCs可产生一系列神经营养因子如⑶NF，BDNF, NGF, NT-3, NT_4/5[57]，但这些因子表达有限因而作用甚微。因此，GDNF修饰的胚胎NSCs的构建为神经系统疾病，尤其是脊髓损伤、帕金森氏综合症、脊髓侧束硬化症等疾病提供了新的更好的治疗方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是构建一种胶质细胞源生神经营养因子基因(GDNF)修饰的胚胎神经干细胞(NSCs)。所构建的⑶NF-NSCs对神经元具有明显的促存活作用，对多巴胺神经元具有重要的营养作用，同时仍然保持了 NSCs的干细胞特性，且回输体内后长期存活并可分化成稳定表达外源基因的神经元、少突胶质细胞和星型胶质细胞，为许多神经系统疾病如脊髓损伤、帕金森氏综合症、脊髓侧束硬化症等的治疗提供了新方法。技术方案本专利技术的目的是按如下技术方案实现的。胶质细胞源生的神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建，其特征是:它按如下步序进行:(I)质粒转化大肠杆菌，将质粒pSK/⑶NF和逆转录病毒表达载体pLNCX2分别加入感受态大肠杆菌，并抽提与纯化质粒DNA。(2)限制性内切 酶消化，用限制性内切酶分别消化质粒pSK/GDNF或pLNCX2，并回收 DNA。(3)目的基因与载体的连接、转化和克隆鉴定，将目的GDNF和载体pLNCX2大片段DNA在连接酶的作用下连接、转化大肠杆菌，并进行克隆鉴定。(4)重组逆转录病毒的包装，将质粒PLNCX2-GDNF转染包装细胞PT67，并筛选阳性克隆(暂时命名为PT67-GDNF)。(5) PCR鉴定重组逆转录病毒的包装，阳性克隆pT67-GDNF细胞基因组DNA进行PCR扩增鉴定。(6)病毒滴度的测定，将PT67-GDNF细胞培养上清液收集，加入小鼠成纤维细胞培养液，并筛选抗性克隆。(7)大鼠胚胎神经干细胞的体外培养，取怀孕SD大鼠大脑皮质组织经Trypsin消化后，用DMEM-F12培养液培养传代。(8)病毒感染胚胎神经干细胞及免疫组化鉴定，将PT67-GDNF细胞上清液感染NSCs,并筛选得阳性克隆。转基因神经球以免疫组化染色鉴定。(9) Western印迹鉴定⑶NF_NSCs，抽取待鉴定的转基因胚胎神经干细胞⑶NF-NSCs蛋白，行Western印迹并免疫组化鉴定。(10) ELISA测定⑶NF-NSCs的⑶NF含量，将⑶NF-NSCs细胞上清液收集，以ELISA法测定⑶NF的含量。(11)转基因干细胞⑶NF-NSCs生物活性检测，取大鼠中脑多巴胺组织细胞培养后，加入NSCs-GDNF细胞培养上清液检测⑶NF的生物活性。所述步序(I)采用的大肠杆菌是TGl，培养基是LB，质粒pSK/⑶NF和pLNCX2阳性克隆用的抗药基因是Amp，37°C培养12-16小时后挑取阳性菌落常规进行质粒的抽提与纯化。所述步序(2)采用的限制性内切酶分别是HindIII和Notl，总反应体积为200μ 1，反应温度和时间分别是37°C水浴2小时，DNA回收用琼脂糖凝胶电泳法和DNA纯化试剂盒。所述步序⑶连接酶是T4 DNA ligase，连接温度和时间是16°C、14小时，挑选阳性克隆的标准是:直径2-3mm、光滑、湿润、中央隆起的菌落；阳性克隆用质粒纯化试剂盒和琼脂糖凝胶电泳法回收纯化质粒DNA，鉴定用Hind III和Not I酶切看目的基因片段。目的基因⑶NF序列测定采用大鼠⑶NF基因的引物，上游:5’ -TGG GAT GTC GTG GCT GTC TG-3，;下游:5’-CCG CCG CTT GTT TAT CTG GT-3’。所述步序(4)包装细胞pT67细胞培养用DMEM完全培养基并加15%的胎牛血清(FBS)，质粒pLNCX2-GDNF转染用Lipof ectamineTM2000 (脂染明)和 4-8 μ g/ml poly-brene 介导，阳性克隆 pT67_GDNF 的筛选用 500 μ g/ml G418。所述步序(5)PCR采用的引物是Neo基因序列，上游为:5’ -CAAGATGGATTGCACGCAGG-3’ ；下游为:5’ -CCCGCTCAGAAGAACTCGTC-3’，扩增产物用琼脂糖凝胶(1.0%凝胶)鉴定。所述步序(6)病毒滴度测定用的是小鼠成纤维细胞NIH 3T3细胞，培养基是DMEM完全培养基加10%的小牛血清培养； 收集24小时的pT67-GDNF细胞培养上清液感染NIH 3T3细胞，阳性克隆的筛选用400 μ g/ml本文档来自技高网...

【技术保护点】
胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建，其特征是：它按如下步序进行：(1)质粒转化大肠杆菌，将质粒pSK/GDNF和逆转录病毒表达载体pLNCX2分别加入感受态大肠杆菌，并抽提与纯化质粒DNA。(2)限制性内切酶消化，用限制性内切酶分别消化质粒pSK/GDNF或pLNCX2，并回收DNA。(3)目的基因与载体的连接、转化和克隆鉴定，将目的GDNF和载体pLNCX2大片段DNA在连接酶的作用下连接、转化大肠杆菌，并进行克隆鉴定。(4)重组逆转录病毒的包装，将质粒pLNCX2?GDNF转染包装细胞pT67，并筛选阳性克隆(暂时命名为pT67?GDNF)。(5)PCR鉴定重组逆转录病毒的包装，阳性克隆pT67?GDNF细胞基因组DNA进行PCR扩增鉴定。(6)病毒滴度的测定，将pT67?GDNF细胞培养上清液收集，加入小鼠成纤维细胞培养液，并筛选抗性克隆。(7)大鼠胚胎神经干细胞的体外培养，取怀孕SD大鼠大脑皮质组织经Trypsin消化后，用DMEM?F12培养液培养传代。(8)病毒感染胚胎神经干细胞及免疫组化鉴定，将pT67?GDNF细胞上清液感染NSCs，并筛选得阳性克隆。转基因神经球以免疫组化染色鉴定。(9)Western印迹鉴定GDNF?NSCs，抽取待鉴定的转基因胚胎神经干细胞GDNF?NSCs蛋白，行Western印迹并免疫组化鉴定。(10)ELISA测定GDNF?NSCs的GDNF含量，将GDNF?NSCs细胞上清液收集，以ELISA法测定GDNF的含量。(11)转基因干细胞GDNF?NSCs生物活性检测，取大鼠中脑多巴胺组织细胞培养后，加入NSCs?GDNF细胞培养上清液检测GDNF的生物活性。...

【技术特征摘要】
1.胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建，其特征是:它按如下步序进行: (1)质粒转化大肠杆菌，将质粒pSK/GDNF和逆转录病毒表达载体PLNCX2分别加入感受态大肠杆菌，并抽提与纯化质粒DNA。(2)限制性内切酶消化，用限制性内切酶分别消化质粒pSK/GDNF或pLNCX2，并回收DNA。(3)目的基因与载体的连接、转化和克隆鉴定，将目的GDNF和载体pLNCX2大片段DNA在连接酶的作用下连接、转化大肠杆菌，并进行克隆鉴定。(4)重组逆转录病毒的包装，将质粒PLNCX2-GDNF转染包装细胞pT67，并筛选阳性克隆(暂时命名为pT67-GDNF)。(5)PCR鉴定重组逆转录病毒的包装，阳性克隆pT67-GDNF细胞基因组DNA进行PCR扩增鉴定。(6)病毒滴度的测定，将PT67-GDNF细胞培养上清液收集，加入小鼠成纤维细胞培养液，并师选抗性克隆。(7)大鼠胚胎神经干细胞的体外培养，取怀孕SD大鼠大脑皮质组织经Trypsin消化后，用DMEM-F12培养液培养传代。(8)病毒感染胚胎神经干细胞及免疫组化鉴定，将PT67-GDNF细胞上清液感染NSCs，并筛选得阳性克隆。转基因神经球以免疫组化染色鉴定。(9)Western印迹鉴 定⑶NF-NSCs,抽取待鉴定的转基因胚胎神经干细胞⑶NF-NSCs蛋白，行Western印迹并免疫组化鉴定。 (10)ELISA测定⑶NF-NSCs的⑶NF含量，将⑶NF-NSCs细胞上清液收集，以ELISA法测定⑶NF的含量。(11)转基因干细胞⑶NF-NSCs生物活性检测，取大鼠中脑多巴胺组织细胞培养后，加入NSCs-GDNF细胞培养上清液检测⑶NF的生物活性。2.根据权利要求1所述的胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建，其特征是:所述步序(I)质粒转化大肠杆菌，将TGl大肠杆菌接种于LB液体培养基，以制备感受态大肠杆菌。同时将含GDNF的质粒pSK/GDNF和质粒pLNCX2分别加入到感受态细胞悬液中，转至LB平板培养并挑取阳性菌落进行质粒的抽提与纯化。3.根据权利要求1所述的胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建，其特征是:所述步序(2)限制性内切酶消化质粒，使用HindIII和NotI分别消化纯化的pSK/⑶NF质粒和pLNCX2质粒，琼脂糖凝胶电泳法进行DNA回收。4.根据权利要求1所述的胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建，其特征是:所述步序(3)目的基因与载体的连接、转化及克隆鉴定，经过酶切且胶回收的目的⑶NF和载体pLNCX2大片段DNA在T4 DNA Iigase连接酶的作用下，经16°C反应14小时后，转化大肠杆菌。阳性克隆用Hind III和Not I酶切纯化的质粒，命名为pLNCX2-GDNF质粒。其鉴定采用⑶NF基因全长序列的测定法，使用的一对引物上游:5’ -TGG GAT GTCGTGGCT GTC TG-3，:下游:5，-CCG CCG CTT GTT TAT CTG GT-3，。5.根据权利要求1所述的胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建，其特征是:所述步序⑷重组逆转录病毒的包装，成纤维细胞PT67细胞培养用DMEM完全培养基并加15%的胎牛血清(FBS)培养，细胞汇合度达80 %时用Lipofectamine 2000 (脂染明)将质粒pLNCX2_GDNF转染包装细胞pT67，G418筛选阳性克隆并定名为PT67-GDNF。6.根据权利要求1所述的胶质细胞源生神经营养因子基因修饰的胚胎神经干细胞构建，其特征是:所述步序(5) 0 鉴定重组逆转录病毒的包装，？了...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙勇，
申请(专利权)人：孙勇，
类型：发明
国别省市：