多价结合蛋白组合物制造技术

本发明专利技术提供了与一种或多种所需靶抗原特异性结合的多价结合蛋白。本公开内容还提供了编码多价结合蛋白的核酸、载体和宿主细胞，多价结合蛋白的生产方法和使用方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请本专利申请要求来自于2012年12月28日提交的美国临时申请号61/746,629、61/746,659、61/746,663、61/746,617、61/746,615和61/746,619，于2013年1月22日提交的美国临时申请61/755,288，以及于2013年3月15日提交的美国临时申请61/786,829的优先权。前述专利申请各自的内容在此以引用的方式全文并入本文。
本公开内容提供了与一种或多种所需靶抗原特异性结合的多价结合蛋白。本公开内容还提供了编码多价结合蛋白的核酸、载体和宿主细胞，多价结合蛋白的生产方法和使用方法。
技术介绍
广泛多样的多特异性抗体形式已得到开发(参见Kriangkum，J.等人，Biomol Eng，2001.18(2)：第31-40页)。在其中，串联单链Fv分子和双抗体及其多种衍生物是用于构建重组双特异性抗体的最广泛使用的形式。最近以来，双抗体已融合至Fc，以生成更Ig样分子，命名为双-双抗体(di-diabody)(参见Lu，D.等人，J Biol Chem，2004.279(4)：第2856-65页)。另外，包含在IgG的重链中的两个Fab重复且能够结合四个抗原分子的多价抗体构建体已得到描述(参见WO 0177342A1和Miller，K.等人，J Immunol，2003.170(9)：第4854-61页)。尽管技术人员可获得许多多特异性抗体形式，本领域仍存在对改良的多特异性结合蛋白形式的需要。
技术实现思路
本公开内容提供了能够同时结合两种或更多种抗原的新型多价结合蛋白。因此，在一个方面，本公开内容提供了具有通式VH1-(X1)n-VH2-X2-VL1-(X3)n-VL2的单链多价结合蛋白，其中VH1是第一抗体重链可变结构域，X1是接头，前提是它不是恒定结构域，VH2是第二抗体重链可变结构域，X2是接头，VL1是第一抗体轻链可变结构域，X3是接头，前提是它不是恒定结构域，VL2是第二抗体轻链可变结构域，并且n为0或1，并且其中VH1和VL1以及VH2和VL2各自组合，以形成两个功能抗原结合位点。在另一个方面，本公开内容提供了具有通式CH1-(X0)n-VH1-(X1)n-VH2-X2-CL1-X4-VL1-(X3)n-VL2的单链多价结合蛋白，其中CH1是重链恒定结构域，X0是接头，前提是它不是恒定结构域，VH1是第一抗体重链可变结构域，X1是接头，前提是它不是恒定结构域，VH2是第二抗体重链可变结构域，X2是接头，CL1是轻链恒定结构域，X4是接头，前提是它不是恒定结构域，VL1是第一抗体轻链可变结构域，X3是接头，前提是它不是恒定结构域，VL2是第二抗体轻链可变结构域，并且n为0或1，并且其中VH1和VL1以及VH2和VL2各自组合，以形成两个功能抗原结合位点。在另一个方面，本公开内容提供了具有通式(VL1-(X1)n-VL2-X2-VH1-(X3)n-VH2的单链多价结合蛋白，其中VL1是第一抗体轻链可变结构域，X1是接头，前提是它不是恒定结构域，VL2是第二抗体轻链可变结构域，X2是接头，VH1是第一抗体重链可变结构域，X3是接头，前提是它不是恒定结构域，VH2是第二抗体重链可变结构域，并且n为0或1，并且其中VH1和VL1以及VH2和VL2各自组合，以形成两个功能抗原结合位点。在另一个方面，本公开内容提供了具有通式CL1-(X0)n-VL1-(X1)n-VL2-X2-CH1-X4-VH1-(X3)n-VH2的单链多价结合蛋白，其中CH1是重链恒定结构域，X0是接头，前提是它不是恒定结构域，VH1是第一抗体重链可变结构域，X1是接头，前提是它不是恒定结构域，VH2是第二抗体重链可变结构域，X2是接头，CL1是轻链恒定结构域，X4是接头，前提是它不是恒定结构域，VL1是第一抗体轻链可变结构域，X3是接头，前提是它不是恒定结构域，VL2是第二抗体轻链可变结构域，并且n为0或1，并且其中VH1和VL1以及VH2和VL2各自组合，以形成两个功能抗原结合位点。在某些实施例中，前述单链多价结合蛋白是单链双重可变结构域免疫球蛋白分子(scDVD)。在某些实施例中，前述单链多价结合蛋白是单链双重可变结构域Fab免疫球蛋白分子(scDVDFab)。在某些实施例中，单链双重可变结构域Fab免疫球蛋白分子的CL1结构域是κ(hcκ或cκ)恒定结构域。在某些实施例中，单链双重可变结构域Fab免疫球蛋白分子的CL1结构域是λ(hcλ或cλ)恒定结构域。在某些实施例中，X2是(G4S)n，其中n＝1-10。在某些实施例中，X2包含具有通式A-B-C-D的氨基酸序列，其中A和C是柔性氨基酸接头区，并且其中C和D是刚性氨基酸接头区。在某些实施例中，X2具有通式A-B-C-D，其中：A是GGGSGGG；B是TPAPLPAPLPT、TPAPTPAPLPAPLPT、TPAPLPAPTPAPLPAPLPT或TPAPLPAPLPAPTPAPLPAPLPT；C是GGSGG；并且D是TPLPAPLPAPT、TPLPTPLPAPLPAPT、TPLPAPLPTPLPAPLPAPT或TPLPAPLPAPLPTPLPAPLPAPT。在某些实施例中，X2包含图14B中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，X1选自图5中所示的氨基酸序列。在某些实施例中，X3选自图5中所示的氨基酸序列。在另一个方面，本公开内容提供了交叉多价结合蛋白。在某些实施例中，本公开内容提供了包含第一多肽链和第二多肽链的结合蛋白，其中所述第一多肽链包含VL1-(X1)n-VL2-(X2)n-CL-(X3)n，其中VL1是第一轻链可变结构域，VL2是第二轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，X1和X2是接头，前提是它们不是恒定结构域，并且如果X6不是Fc区，则X3是Fc区；其中所述第二多肽链包含VH2-(X4)n-VH1-(X5)n-CH-(X6)n，其中VH1是第一重链可变结构域，VH2是第二重链可变结构域，CH是重链恒定结构域，X4和X5是接头，前提是它们不是恒定结构域，并且如果X3不是Fc区，则X6是Fc区；其中n为0或1，其中VL1和VH1结构域形成关于抗原A的一个功能结合位点，并且其中VL2和VH2结构域形成关于抗原B的一个功能结合位点。在某些实施例中，本公开内容提供了包含第一多肽链和第二多肽链的结合蛋白，其中所述第一多肽链包含VH2-(X1)n-VH1-(X2)n-CL-(X3)n本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有通式VH1‑(X1)n‑VH2‑X2‑VL1‑(X3)n‑VL2的单链多价结合蛋白，其中VH1是第一抗体重链可变结构域，X1是接头，前提是它不是恒定结构域，VH2是第二抗体重链可变结构域，X2是接头，VL1是第一抗体轻链可变结构域，X3是接头，前提是它不是恒定结构域，VL2是第二抗体轻链可变结构域，并且n为0或1，并且其中所述VH1和VL1以及所述VH2和VL2各自组合以形成两个功能抗原结合位点。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.12.28 US 61/746，617;2012.12.28 US 61/746，629;1.一种具有通式VH1-(X1)n-VH2-X2-VL1-(X3)n-VL2的单链多价结合蛋白，
其中VH1是第一抗体重链可变结构域，X1是接头，前提是它不是恒定结构域，
VH2是第二抗体重链可变结构域，X2是接头，VL1是第一抗体轻链可变结构域，
X3是接头，前提是它不是恒定结构域，VL2是第二抗体轻链可变结构域，并且
n为0或1，并且其中所述VH1和VL1以及所述VH2和VL2各自组合以形成两
个功能抗原结合位点。
2.一种具有通式CH1-(X0)n-VH1-(X1)n-VH2-X2-CL1-X4-VL1-(X3)n-VL2的
单链多价结合蛋白，其中CH1是重链恒定结构域，X0是接头，前提是它不是恒
定结构域，VH1是第一抗体重链可变结构域，X1是接头，前提是它不是恒定结
构域，VH2是第二抗体重链可变结构域，X2是接头，CL1是轻链恒定结构域，
X4是接头，前提是它不是恒定结构域，VL1是第一抗体轻链可变结构域，X3是
接头，前提是它不是恒定结构域，VL2是第二抗体轻链可变结构域，并且n为0
或1，并且其中所述VH1和VL1以及所述VH2和VL2各自组合以形成两个功
能抗原结合位点。
3.一种具有通式(VL1-(X1)n-VL2-X2-VH1-(X3)n-VH2的单链多价结合蛋白，
其中VL1是第一抗体轻链可变结构域，X1是接头，前提是它不是恒定结构域，
VL2是第二抗体轻链可变结构域，X2是接头，VH1是第一抗体重链可变结构域，
X3是接头，前提是它不是恒定结构域，VH2是第二抗体重链可变结构域，并且
n为0或1，并且其中所述VH1和VL1以及所述VH2和VL2各自组合以形成两
个功能抗原结合位点。
4.一种具有通式CL1-(X0)n-VL1-(X1)n-VL2-X2-CH1-X4-VH1-(X3)n-VH2的
单链多价结合蛋白，其中CH1是重链恒定结构域，X0是接头，前提是它不是恒
定结构域，VH1是第一抗体重链可变结构域，X1是接头，前提是它不是恒定结
构域，VH2是第二抗体重链可变结构域，X2是接头，CL1是轻链恒定结构域，
X4是接头，前提是它不是恒定结构域，VL1是第一抗体轻链可变结构域，X3是
接头，前提是它不是恒定结构域，VL2是第二抗体轻链可变结构域，并且n为0
或1，并且其中所述VH1和VL1以及所述VH2和VL2各自组合以形成两个功
能抗原结合位点。
5.根据权利要求1或3所述的结合蛋白，其为单链双重可变结构域免疫球蛋
白分子(scDVD)。
6.根据权利要求2或4所述的结合蛋白，其为单链双重可变结构域Fab免疫
球蛋白分子(scDVDFab)。
7.根据权利要求2或4所述的结合蛋白，其中所述CL1结构域是κ(hcκ或
cκ)恒定结构域。
8.根据权利要求2或4所述的结合蛋白，其中所述CL1结构域是λ(hcλ或
cλ)恒定结构域。
9.根据前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其中X2是(G4S)n，其中
n＝1-10。
10.根据前述权利要求中任一项所述的结合蛋白，其中X2包含具有通式
A-B-C-D的氨基酸序列，其中A和C是柔性氨基酸接头区，并且其中C和D是
刚性氨基酸接头区。
11.根据权利要求10所述的结合蛋白，其中：
A是GGGSGGG；B是TPAPLPAPLPT、TPAPTPAPLPAPLPT、
TPAPLPAPTPAPLPAPLPT或TPAPLPAPLPAPTPAPLPAPLPT；C是GGSGG；并
且D是TPLPAPLPAPT、TPLPTPLPAPLPAPT、TPLPAPLPTPLPAPLPAPT或
TPLPAPLPAPLPTPLPAPLPAPT。
12.根据所述的结合蛋白，其中X2包含图14B中所示的氨基酸序列。
13.根据前述权利要求中任一项所述的文库，其中X1选自图5中所示的氨
基酸序列。
14.根据前述权利要求中任一项所述的文库，其中X3选自图5中所示的氨
基酸序列。
15.一种包含第一多肽链和第二多肽链的结合蛋白，
其中所述第一多肽链包含VL1-(X1)n-VL2-(X2)n-CL-(X3)n，其中VL1是第
一轻链可变结构域，VL2是第二轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，X1和
X2是接头，前提是它们不是恒定结构域，并且如果X6不是Fc区，则X3是Fc
区；
其中所述第二多肽链包含VH2-(X4)n-VH1-(X5)n-CH-(X6)n，其中VH1是第
-重链可变结构域，VH2是第二重链可变结构域，CH是重链恒定结构域，X4
和X5是接头，前提是它们不是恒定结构域，并且如果X3不是Fc区，则X6是
Fc区；
其中n为0或1，其中所述VL1和VH1结构域形成关于抗原A的一个功能
结合位点，并且其中所述VL2和VH2结构域形成关于抗原B的一个功能结合位

\t点。
16.一种包含第一多肽链和第二多肽链的结合蛋白，
其中所述第一多肽链包含VH2-(X1)n-VH1-(X2)n-CL-(X3)n，其中VH1是第
一轻链可变结构域，VH2是第二轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，X1
和X2是接头，前提是它们不是恒定结构域，并且如果X6不是Fc区，则X3是
Fc区；
其中所述第二多肽链包含VL1-(X4)n-VL2-(X5)n-CH-(X6)n，其中VL1是第
一重链可变结构域，VL2是第二重链可变结构域，CH是重链恒定结构域，X4
和X5是接头，前提是它们不是恒定结构域，并且如果X3不是Fc区，则X6是
Fc区；
其中n为0或1，其中所述VL1和VH1结构域形成关于抗原A的一个功能
结合位点，并且其中所述VL2和VH2结构域形成关于抗原B的一个功能结合位
点。
17.一种包含第一多肽链和第二多肽链的结合蛋白，
其中所述第一多肽链包含VL1-(X1)n-VH2-(X2)n-CL-(X3)n，其中VL1是第
一轻链可变结构域，VH2是第二重链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，X1
和X2是接头，前提是它们不是恒定结构域，并且如果X6不是Fc区，则X3是
Fc区；
其中所述第二多肽链包含VL2-(X4)n-VH1-(X5)n-CH-(X6)n，其中VL2是第
二轻链可变结构域，VH1是第一重链可变结构域，CH是重链恒定结构域，X4
和X5是接头，前提是它们不是恒定结构域，并且如果X3不是Fc区，则X6是
Fc区；
其中n为0或1，其中所述VL1和VH1结构域形成关于抗原A的一个功能
结合位点，并且其中所述VL2和VH2结构域形成关于抗原B的一个功能结合位
点。
18.一种包含第一多肽链和第二多肽链的结合蛋白，
其中所述第一多肽链包含VH1-(X1)n-VL2-(X2)n-CL-(X3)n，其中VH1是第
一重链可变结构域，VL2是第二轻链可变结构域，CL是轻链恒定结构域，X1和
X2是接头，前提是它们不是恒定结构域，并且如果X6不是Fc区，则X3是Fc
区；
其中所述第二多肽链包含VH2-(X4)n-VL1-(X5)n-CH-(X6)n，其中VL1是第
一轻链可变结构域，VH2是第二重链可变结构域，CH是重链恒定结构域，X4

\t和X5是接头，前提是它们不是恒定结构域，并且如果X3不是Fc区，则X6是
Fc区；
其中n为0或1，其中所述VL1和VH1结构域形成关于抗原A的一个功能
结合位点，并且其中所述VL2和VH2结构域形成关于抗原B的一个功能结合位
点。
19.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：T哈于尔，L贝纳特伊尔，谢仲明，顾继杰，MC哈里斯，DJ安布罗西，
申请(专利权)人：艾伯维公司，
类型：发明
国别省市：美国;US