多特异单克隆抗体制造技术

本发明专利技术涉及多特异性抗体的产生，该抗体的特征在于其以特异性和亲和性与多个抗原结合的能力。尤其是，本发明专利技术涉及双特异性抗体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多特异单克隆抗体
本专利技术涉及多特异性抗体的产生，该抗体的特征在于，其以特异性和亲和性与多个抗原结合的能力。尤其是，本专利技术涉及双特异性抗体。本专利技术还涉及结合一个以上靶标的其他多特异蛋白质。
技术介绍
虽然众所周知，低亲和性(大约>1uM)抗体通常结合多个抗原，但是通常将天然和人工的亲和性成熟和优化方法(定向演化或者分子演化)设计成增加仅仅针对处于高亲和性的分子的单个表位的亲和性和特异性。通常，对于大部分应用，特异性是重要的特性；例如，在治疗学中特异性可以防止可能降低分子的安全性的脱靶效应。然而，结合有限数量(例如2、3、4、5、6、7、8、9或者10，但是优选2或者3)的选定的靶抗原的能力具有实质的用途，尤其是例如用于治疗其中存在多个活化路径的疾病，诸如与癌症相关的疾病。定期用单克隆抗体对癌症进行免疫治疗，并不激活T-细胞，因为它们不表达Fc-受体。双特异性抗体(一条臂结合肿瘤标志物，一条臂结合T-细胞特异表面抗原，例如CD3)可以克服该问题并且连接肿瘤细胞和T-细胞。另外，三功能性抗体(具有2种不同的结合特异性和完整Fc结构域的IgG)还可以结合至Fc受体表达细胞，如巨噬细胞和树突细胞。然后肿瘤细胞被连接至免疫系统的一个或多个细胞，该免疫系统随后消灭肿瘤细胞。数个团队已经尝试设计双特异性抗体，例如通过双硫键还原拆分两个独立的抗体的抗体重链，然后在氧化环境下再聚集抗体来制造异源抗体，从而Fab的二价IgG分子不同并且结合至单独的抗原。该方法的缺点在于对相同的目标分子无亲合力，并且带来成本高的产品生产及纯化过程。也开发了其他方案，其包括Fab内的序列扩增，有效地复制抗体上的抗原结合口袋，从而每个结合口袋可以具有对单个抗体分子的不同抗原特异性。虽然这简化了生产和纯化，但是该结构对于人体是外来的并且存在刺激患者内的负免疫反应的风险。其他团队利用新颖的共价连接以实现多表位结合，从而产生“抗体类”分子。可能难以生产传统的双特异或者多特异性抗体。例如，通过表达同一细胞中的两个单独的重链和两个单独的轻链可以构建这些抗体(Quadromatechnology,Milsteinetal,1983)，然而，该方法存在问题，因为除了期望的轻链1/重链1-重链2/轻链2异二聚体，将总共形成10个可能的重链和轻链组合(Sureshetal.,1986)。多余的轻链/重链配对的结合亲和性和特异性是未知的。为了降低得到的种群的可能的轻链/重链组装的复杂性作出的努力包括诸如“杵臼”设计(“knobinhole”design,Ridgewayetal.,1996，通过引用并入本文)的方法，其中可以修饰重链的Fc部分以消除一些同源二聚体的形成。然而，即便是有这些改变，利用传统技术该种群仍然复杂。期望的双特异(或者多特异)产物只是混合物的一小部分，使得双特异(多特异)抗体的纯化困难并且有时在许多情况下以商业规模是不可取的。本专利技术的多特异性抗体的特征在于其以特异性和亲和性(例如，<10nM)结合至多个抗原的能力。在一个方面，本专利技术的多特异性抗体包含两个不同的重链可变结构域(结合两个或以上的不同抗原)、匹配两个重链可变结构域或者已经被优化以匹配两个重链的单个轻链可变结构域、以及形成异源二聚体或者已经被优化以形成异源二聚体的Fc。可以以若干途径实现本专利技术的多特异性抗体的构建。例如，在一种途径中，利用若干方法(包括本文描述的方法)中的其中一种演化两个亲本单克隆抗体的可变结构域，从而同一单条轻链可以在功能上补充来自亲本抗体的两条重链。还可以演化单个亲本抗体的重链，从而其可以结合第二靶标，产生新的重链，随后用来自亲本抗体的轻链配对新的重链。在又一途径中，可以演化单个亲本抗体的轻链，从而其可以结合第二靶标，产生新的轻链，然后用来自亲本抗体的重链配对新的轻链。采用“杵臼”型途径或者促使Fc形成或者导致Fc形成异源二聚体的任何其他途径，可以产生形成本专利技术的多特异性抗体的异源二聚体的Fc部分。本文进一步描述了构建本专利技术的多特异性抗体的实例。本专利技术的多特异性抗体特异性结合3个表位。本专利技术的多特异性抗体特异性结合4个表位。本专利技术的多特异性抗体特异性结合5个或更多个表位。此外，本专利技术的多特异性抗体不限于结合同一靶标(抗原)上的表位。在一个实施方案中，在分离本专利技术的多特异性抗体之后，通过演化方法可以进一步改善多特异性抗体与一个或多个抗原或者靶标的亲和性，例如综合演化方法(comprehensiveevolutionprocess)。在综合演化方法的一个方面中，在筛选期间鉴别高表达突变体(up-mutant)，因为这些突变体改善与至少一个或两个抗原的结合而不会导致降低与其中任一抗原的结合。然后可以进一步例如组合地混合和匹配这些高表达突变体(改变可以位于重链和/或轻链内)。在某些其他例子中，期望与其中一个靶抗原的较低亲和性和与另一靶抗原的较高亲和性。例如，Y.JoyYu等在ScienceTranslationalMedicine,25May2011,Vol3,Issue8484ra44，“BoostingBrainUptakeofaTherapeuticAntibodybyReducingItsAffinityforaTranscytosisTarget”上发表了一种双特异性抗体，其具有包含低亲和性抗转铁蛋白受体抗体的一条臂和包括高亲和性BACE1抗体的另一条臂，该双特异性抗体能够穿过血脑屏障并且在小鼠脑中达到治疗浓度。与亲本单特异抗体相比，该双特异性抗体有效得多。因此，在综合演化方法的另一方面中，在筛选期间鉴别高表达突变体，因为那些突变体改善与一个抗原的结合。虽然不优选导致与第二抗原的结合亲和性降低的突变体，但是这些突变体在以组合方法在突变组合方法期间与其他突变组合时失去抑制效应的情况下是有用的。基于候选物的整体亲和性以及其各自的与每一所选抗原的抗原:抗体结合的打开和关闭率(onandoffrate)，可以实施筛选以鉴别最重要的候选物。还可以优化本专利技术的多特异性抗体，以增加或者降低在其他条件中的活性或者稳定性，诸如pH、氧化、温度、压力或者不同的离子浓度。附图简要说明图1示出本专利技术的H2L抗体的一个实施方案。H2L抗体具有优化的可变结构域，其允许同一轻链与来自2个不同的亲本抗体(抗体1和抗体2)的2条重链中的每一条组装而不改变对于特定抗原的结合特异性。轻链与来自抗体1的重链1组装而形成结合抗原1的“Fab-臂1-H2L”。同一轻链还与来自抗体2的重链2组装而形成结合抗原2的“Fab-臂2-H2L”。以只允许HC1-HC2二聚体在体内形成的方式修饰重链的Fc部分(例如，在本实例中通过“杵臼”设计促进，并且标记成Fc异源二聚体)。只形成异源二聚体的2条重链和单条轻链的表达导致仅仅形成单一产物，即本专利技术的“H2LmAb”抗体。产生的每个分子具有结合抗原1的一条Fab臂和结合抗原2的另一条Fab臂。可以类似于普通的IgG一样生产和纯化H2LmAb。图2示出筛选排列的人类免疫球蛋白轻链文库的实例。用重链HC1和完全的人轻链(不同的轻链位于每个孔中)组成的重组IgG孵育微量滴定板中固定的抗原靶标A。在用抗人IgG-HRP缀合物清洗后检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生多特异性抗体的方法，所述方法包括：(a)鉴别在功能上补充两个不同的免疫球蛋白重链(HC)可变抗体区的单个免疫球蛋白轻链(LC)可变抗体区；(b)在修饰了IgG恒定结构域的情况下在框架中克隆所述两个不同的免疫球蛋白重链(HC)可变抗体区，从而使其不再组装形成免疫球蛋白重链同源二聚体；(c)在宿主细胞中共表达所述免疫球蛋白轻链(LC)可变抗体区和所述两个不同的免疫球蛋白重链(HC)可变抗体区以产生多特异性抗体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.05.10 US 61/645,3021.一种产生多特异性抗体的方法，所述方法包括：(a)鉴别在功能上补充两个不同的分别结合抗原1和抗原2的免疫球蛋白重链(HC)可变抗体区的单个免疫球蛋白轻链(LC)可变抗体区；包括以下步骤：(i)筛选抗体文库以得到结合所述抗原1的抗体；(ii)筛选另一个抗体文库以得到结合所述抗原2的抗体；(iii)通过以下选择抗体：(1)共表达获自步骤(i)的结合所述抗原1的抗体的轻链和结合所述抗原2的免疫球蛋白重链可变抗体区，并选择出结合所述抗原2的抗体，或(2)共表达获自步骤(ii)的结合所述抗原2的抗体的轻链与结合所述抗原1的免疫球蛋白重链可变抗体区域，并选择出结合所述抗原1的抗体，其中在步骤(1)或(2)中所选择出的抗体的轻链可变区是在功能上补充两个不同的免疫球蛋白重链可变抗体区的免疫球蛋白轻链可变区；(b)在修饰了IgG恒定结构域的情况下在框架中克隆所述两个不同的免疫球蛋白重链(HC)可变抗体区，从而使其不再组装以形成免疫球蛋白重链同源二聚体；(c)在宿主细胞中共表达所述免疫球蛋白轻链(LC)可变抗体区和所述两个不同的免疫球蛋白重链(HC)可变抗体区以产生所述多特异性抗体。2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(b)中的所述修饰是向两个免疫球蛋白重链中的一个的CH3结构域内引入氨基酸侧链，所述氨基酸侧链匹配两个免疫球蛋白重链中的另一个的CH3结构域中的适当设计的腔。3.根据权利要求1所述的方法，还包括演化所述轻链或任一重链以改善所述多特异性抗体的一种或多种特性的额外步骤。4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述一种或多种特性选自：平衡解离常数(KD)、稳定性、解链温度(Tm)；pI、溶解度、表达水平、降低的免疫原性和改善的效应器功能。5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述额外的演化步骤包括以下之一：综合位置演化(CPE)；综合位置插入演化(CPI)、综合位置缺失演化(CPD)；由组合蛋白合成(CPS)跟随的综合位置演化(CPE)；以及由组合蛋白合成(CPS)跟随的综合位置缺失演化(CPD)。6.根据权利要求1所述的方法，还包括使所述多特异性抗体与有机部分缀合以产生缀合的多特异性抗体。7.根据权利要求1所述的方法，其中所述两个重链均源自相同的亲本抗体。8.根据权利要求1所述的方法，进一步包括以下步骤：演化所述多特异性抗体以产生突变抗体；以及筛选突...

【专利技术属性】
技术研发人员：格那德·弗雷，华文昌，杰·M·少特，
申请(专利权)人：生物蛋白有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US