用于HER2的嵌合抗原受体和其使用方法技术

本公开提供了与HER2结合的嵌合抗原受体(CAR)和包括编码所述CAR的核苷酸序列的核酸以及与HER2结合的条件活性生物(CAB)CAR。本公开提供了被基因修饰以产生所述CAR的细胞、包括这些经基因修饰的细胞的递送悬浮液以及用于制备此类细胞的方法。本公开的所述CAR可以在同样被提供的各种方法中使用，所述方法包含用于在某些条件下激活免疫细胞的方法以及用于执行如CAR疗法等过继性细胞疗法的方法，所述CAR疗法例如针对癌症的CAR疗法。述CAR疗法例如针对癌症的CAR疗法。述CAR疗法例如针对癌症的CAR疗法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于HER2的嵌合抗原受体和其使用方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2020年1月23日提交的美国临时申请第62/964,947号的权益。本申请通过全文引用的方式并入本文中。
[0003]序列表
[0004]本申请在此以引用的方式并入有与此同时提交的电子序列表材料。电子序列表中的材料以2021年1月22日创建的标题为“F1_005_WO_01_Sequence_Listing.txt”的文本(.txt)文档形式提交，其文件大小是354KB并且以全文引用的方式并入本文中。
[0005]联合研究协议
[0006]F1 Oncology公司(现被称为埃秀马生物科技公司(Exuma Biotech Corp.))和百奥生物有限责任公司(BioAtla，LLC)是与本文所公开的主题相关的联合研究协议的当事方。


[0007]本公开涉及嵌合抗原受体和所述嵌合抗原受体在诊断和治疗方法中的用途。

技术介绍

[0008]在基于细胞的过继性免疫疗法中，从患者分离的免疫细胞可以被修饰为表达合成蛋白，所述合成蛋白使细胞在随后被转移回到患者中之后能够执行新的治疗功能。此类合成蛋白的实例是嵌合抗原受体(CAR)。目前使用的CAR的实例是胞外识别结构域(例如，抗原特异性靶向区域或ASTR)、跨膜结构域和一个或多个细胞内信号传导结构域的融合。在抗原接合时，CAR的细胞内信号传导部分可以在免疫细胞中启动激活相关的应答，如释放溶细胞分子以诱导肿瘤细胞死亡等。尽管CAR和CARr/>‑
T疗法对某些类型的血癌非常有效，但仍然需要针对实体瘤的CAR和CAR
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T疗法，迄今为止已证明所述疗法更加难以捉摸。
[0009]虽然CAR
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T疗法代表了一种用于治疗各种疾病，尤其是血癌的有前景的方法，但CAR
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T疗法的安全性最近因临床试验期间的不良事件而受到质疑。一种用于减少这些不良事件的方法是减少ASTR的中靶脱瘤结合。由于被称为瓦博格效应(Warburg Effect)的癌细胞代谢改变，肿瘤微环境(TME)比正常生理环境酸性更大。具有条件活性ASTR的CAR仅在某些条件下与抗原结合(即条件活性生物CAR(CAB CAR)，如存在于TME中的那些，并且提供减少中靶脱瘤结合，使得CAR不会在正常生理条件下结合抗原。因此，这些CAR的副作用减少，并且治疗可以更安全地进行。尽管开发了此类CAB CAR的某些实例，但仍然需要高效但安全的CAB CAR。此外，仍然需要有效和安全的治疗方法，如针对实体瘤的新型CAB CAR，因为虽然CAR
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T疗法已被证明对治疗某些血癌非常有效，但开发针对实体瘤的有效CAR
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T疗法已经更具挑战性。
[0010]受体酪氨酸激酶(RTK)是通过配体控制的酪氨酸激酶活性调节一系列正常细胞过程的细胞表面受体家族。在过去的20年中，对RTK的放松管制已被证明在癌症发展和进展中发挥关键作用。RTK现在被认为是预后分子生物标志物和肿瘤治疗剂的靶标。肿瘤学中的重
要的RTK是HER2(ERBB2)。HER2受体是在许多组织中表达的1255个氨基酸、185kD跨膜糖蛋白RTK(Iqbal和Iqbal，《国际细胞与分子生物学评论(Mol Biol Int.)》第2014卷，2014：852748)。HER2过表达发生在许多实体癌中，包含例如乳腺癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肺癌和膀胱尿路上皮癌(同前)。尽管HER2的几种抗体和小分子抑制剂被批准用于治疗某些癌症，尤其是转移性乳腺癌，但这些治疗剂通常延长生存期，但不是治愈性的(同前)。例如，相当一部分用批准的靶向HER2的单克隆抗体治疗的患有HER2+乳腺癌的患者最终会复发或发展为进行性疾病。因此，仍然需要开发靶向HER2癌症的有效治疗剂。此外，尽管已经制备了识别HER2的CAR，以尝试提供更有效的抗HER2疗法，但此类CAR会导致安全问题，并且甚至导致患者死亡，这被认为是由于与正常肺细胞的脱靶结合触发了细胞因子风暴(Morgan等人，《分子疗法(Mol.Ther.)》2010；18(4)843
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851)。
[0011]仍然需要一种有效的治疗方法，所述治疗方法利用免疫系统的力量来对抗癌症，但已经减少或消除了中靶脱瘤以及脱靶效应。尽管针对HER2的单克隆抗体是可商购获得的，但仍需要包含靶向HER2的抗体片段的CAR，所述抗体片段具有条件活性，仅在某些环境如癌症微环境中有效靶向表达HER2的细胞。创建此类有条件活性的CAR提出了许多挑战。例如，必须创建和鉴定抗体片段，不仅当所述抗体片段作为CAR的一部分在T细胞或NK细胞的表面上表达时结合HER2，而且另外具有识别暴露在癌细胞上的表位的能力。此外，与正常生理pH值相比，此类CAR理想地以条件活性的方式与其靶标结合，尤其是在肿瘤的酸性pH下。另外地，当此类候选CAR与其靶标结合时，必须激活表达CAR的T细胞或NK细胞以表达细胞毒性功能。因此，对含有此类抗体片段的CAR有很多要求，以帮助解决当前CAR
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T方法带来的问题。此外，由于HER2在许多实体瘤上表达，针对HER2的此类条件活性CAR有望用于使用CAR
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T疗法治疗实体癌，从而克服当前CAR
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T疗法的主要限制。

技术实现思路

[0012]本公开提供了与HER2结合的嵌合抗原受体(CAR)和包括编码所述CAR的核苷酸序列的核酸以及与HER2结合的条件活性生物(CAB)CAR。本公开提供了经基因修饰以产生所述CAR的细胞、包括这些含CAB CAR的细胞(尤其是CAB CART细胞和NK细胞)群体的递送悬浮液以及用于制备此类细胞的方法。本公开的所述CAR可以用于也被提供的各种方法，所述方法包含用于在某些条件如TME的pH下激活免疫细胞的方法，以及用于执行如CAR疗法等过继性细胞疗法，所述CAR疗法例如针对癌症的CAR疗法。在本文所公开的概念验证实验中，使用表达本文所提供的此类CAB CAR的T细胞和/或NK细胞的说明性实例显示，此类CAB CAR T细胞和/或NK细胞是可以克服与中靶脱瘤效应相关的尤其是针对抗HER2 CAR的问题的有效生物制剂。
[0013]在本公开全文中提供了本文所提供的各方面和实施例的细节。为了清楚起见，本
技术实现思路
部分不旨在且不应被解释为限制本文所提供的本公开的范围。
附图说明
[0014]图1A和1B示出了如通过ELISA测量的各种抗体在不同pH值下与人HER2蛋白的结合活性。条件活性抗体与HER2基准抗体(BM)一起示出。
[0015]图2示出了荧光素酶杀伤测定中CHO
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S
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HER2靶细胞的裂解百分比。CHO
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S
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HER2细
胞和CAR
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T效应细胞在低pH和高pH下共培养持续至多6小时。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种编码用于结合HER2的嵌合抗原受体(CAR)的分离的核酸，所述CAR包括：a)抗原特异性靶向区(ASTR)，所述ASTR与HER2蛋白特异性结合；b)跨膜结构域；以及c)细胞内激活结构域，其中所述跨膜结构域定位于所述ASTR与所述细胞内激活结构域之间，并且其中所述ASTR包括重链可变区，所述重链可变区包括具有序列HCDR1、HCDR2和HCDR3的三个互补决定区(CDR)，其中：所述HCDR1序列是GFNIKDTYIH(SEQ ID NO：131)；所述HCDR2序列是X1IYPTNGYTX2YADSVKG(SEQ ID NO∶137)；并且所述HCDR3序列是WGGDGFYAMDY(SEQ ID NO：133)；并且所述ASTR包括轻链可变区，所述轻链可变区包含具有序列LCDR1、LCDR2和LCDR3的三个CDR，其中：所述LCDR1序列是RASQDVNTX3VA(SEQ ID NO：142)；所述LCDR2序列是SASFLYS(SEQ ID NO：135)；并且所述LCDR3序列是QQX4YTTPPT(SEQ ID NO：143)，其中X1是R或K，X2是R或E，X3是A或D，并且X4是H、D或E；并且其中所述ASTR中的X1、X2、X3和X4的组合不是分别为R、R、A和H。2.一种用于结合HER2的嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR包括：a)抗原特异性靶向区(ASTR)，所述ASTR与HER2蛋白特异性结合；b)跨膜结构域；以及c)细胞内激活结构域，其中所述跨膜结构域定位于所述ASTR与所述细胞内激活结构域之间，并且其中所述ASTR包括重链可变区，所述重链可变区包括具有序列HCDR1、HCDR2和HCDR3的三个互补决定区(CDR)，其中：所述HCDR1序列是GFNIKDTYIH(SEQ ID NO：131)；所述HCDR2序列是X1IYPTNGYTX2YADSVKG(SEQ ID NO：137)；并且所述HCDR3序列是WGGDGFYAMDY(SEQ ID NO：133)；并且所述ASTR包括轻链可变区，所述轻链可变区包含具有序列LCDR1、LCDR2和LCDR3的三个CDR，其中：所述LCDR1序列是RASQDVNTX3VA(SEQ ID NO：142)；所述LCDR2序列是SASFLYS(SEQ ID NO：135)；并且所述LCDR3序列是QQX4YTTPPT(SEQ ID NO：143)，其中X1是R或K，X2是R或E，X3是A或D，并且X4是H、D或E；并且其中所述ASTR中的X1、X2、X3和X4的组合不是分别为R、R、A和H。3.一种递送悬浮液，其包括悬浮在递送溶液中的由经基因修饰的T细胞和/或NK细胞构成的群体，其中所述经基因修饰的T细胞和/或NK细胞包括编码用于结合HER2的嵌合抗原受体(CAR)的核酸，所述CAR包括：a)抗原特异性靶向区(ASTR)，所述ASTR与HER2蛋白特异性结合；b)跨膜结构域；以及c)细胞内激活结构域，其中所述跨膜结构域定位于所述ASTR与所述细胞内激活结构域之间，并且其中所述ASTR包括重链可变区，所述重链可变区包括具有序列HCDR1、HCDR2和
HCDR3的三个互补决定区(CDR)，其中：所述HCDR1序列是GFNIKDTYIH(SEQ ID NO：131)；所述HCDR2序列是X1IYPTNGYTX2YADSVKG(SEQ ID NO：137)；并且所述HCDR3序列是WGGDGFYAMDY(SEQ ID NO：133)；并且所述ASTR包括轻链可变区，所述轻链可变区包含具有序列LCDR1、LCDR2和LCDR3的三个CDR，其中：所述LCDR1序列是RASQDVNTX3VA(SEQ ID NO：142)；所述LCDR2序列是SASFLYS(SEQ ID NO：135)；并且所述LCDR3序列是QQX4YTTPPT(SEQ ID NO：143)，其中X1是R或K，X2是R或E，X3是A或D，并且X4是H、D或E；并且其中所述ASTR中的X1、X2、X3和X4的组合不是分别为R、R、A和H。4.根据权利要求1所述的分离的核酸、根据权利要求2所述的CAR或根据权利要求3所述的递送悬浮液，其中X1、X2、X3和X4的所述组合分别是R、R、D和H；分别是R、R、A和D；分别是R、R、A和E；分别是K、R、A和H；或分别是R、E、A和H，其中所述重链可变区和所述轻链可变区由长度介于5个氨基酸与50个氨基酸之间的连接子分开，并且其中所述重链可变区的序列与SEQ ID NO：119至少90％相同，并且其中所述轻链可变区的序列与SEQ ID NO：122至少90％相同。5.根据权利要求1所述的分离的核酸、根据权利要求2所述的CAR或根据权利要求3所述的递送悬浮液，其中X1、X2、X3和X4的所述组合分别是R、R、D和H；分别是R、R、A和D；或分别是R、R、A和E，其中所述重链可变区和所述轻链可变区由长度介于5个氨基酸与50个氨基酸之间的连接子分开，其中所述重链可变区的序列与SEQ ID NO：119至少90％相同，并且其中所述轻链可变区的序列与SEQ ID NO：122至少90％相同。6.根据权利要求1所述的分离的核酸、根据权利要求2所述的CAR或根据权利要求3所述的递送悬浮液，其中X1、X2、X3和X4的所述组合分别是K、R、A和H；或分别是R、E、A和H，其中所述重链可变区和所述轻链可变区由长度介于5个氨基酸与50个氨基酸之间的连接子分开，其中所述重链可变区的序列与SEQ ID NO：119至少90％相同，并且其中所述轻链可变区的序列与SEQ ID NO：122至少90％相同。7.根据权利要求1所述的分离的核酸、根据权利要求2所述的CAR或根据权利要求3所述的递送悬浮液，其中所述CAR是相比在pH为7.4时，在pH为6.7时抗HER2 CAR活性增加的条件活性CAR。8.根据权利要求7所述的分离的核酸、CAR或递送悬浮液，其中所述重链可变区的序列与SEQ ID NO：119至少90％相同，并且其中所述轻链可变区的序列与SEQ ID NO：122至少90％相同。9.根据权利要求1所述的分离的核酸、根据权利要求2所述的CAR或根据权利要求3所述的递送悬浮液，其中所述重链可变区的序列与SEQ ID NO：119至少90％相同，并且其中所述轻链可变区的序列与SEQ ID NO：122至少90％相同。10.根据权利要求9所述的分离的核酸、CAR或递送悬浮液，其中所述重链可变区(HCVR)包括HCVR框架区，所述HCVR框架区具有与由SEQ ID NO：119的残基1
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25、残基36
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49、残基67
‑
98和残基110
‑
120形成的HCVR框架区至少90％相同的序列，并且所述轻链可变区(LCVR)
包括LCVR框架区，所述LCVR框架区具有与由SEQ ID NO：122的残基1
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23、残基35
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49、残基57
‑
88和残基98
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107形成的LCVR框架区至少90％相同的序列。11.根据权利要求10所述的分离的核酸、CAR或递送悬浮液，其中所述重链可变区(HCVR)框架区包括SEQ ID NO：119的残基1
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25、残基36
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49、残基67
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98和残基110
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120，并且其中所述轻链可变区(LCVR)包括SEQ ID NO：122的残基1
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23、残基35
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49、残基57
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88和残基98
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107。12.根据权利要求1所述的分离的核酸、根据权利要求2所述的CAR或根据权利要求3所述的递送悬浮液，其中相比在pH为7.4时，具有所述ASTR的重链和轻链的抗体或其片段在pH为6.7时表现出与HER2的结合增加。13.根据权利要求1所述的分离的核酸、根据权利要求2所述的嵌合抗原受体或根据权利要求3所述的递送悬浮液，其中所述ASTR与包括SEQ ID NO：119的抗体重链可变区和SEQ ID NO：122的抗体轻链可变区的抗体或单链可变抗体片段结合于HER2的相同表位。14.根据权利要求1所述的分离的核酸、根据权利要求2所述的嵌合抗原受体或根据权利要求3所述的递送悬浮液，其中所述ASTR是选自以下的抗体：单链抗体、Fab片段、Fab
′
片段、(Fab
′
)2片段、Fv片段和二价单链抗体或双功能抗体。15.根据权利要求1所述的分离的核酸、根据权利要求2所述的嵌合抗原受体或根据权利要求3所述的递送悬浮液，其中所述ASTR是包括重链可变区和轻链可变区的单链可变片段。16.根据权利要求15所述的分离的核酸、嵌合抗原受体或递送悬浮液，其中重链和轻链由连接子分开，并且其中所述连接子的长度介于5个氨基酸与50个氨基酸之间。17.根据权利要求1所述的分离的核酸、根据权利要求2所述的嵌合抗原受体或根据权利要求3所述的递送悬浮液，其中所述重链可变区和所述轻链可变区由连接子分开，并且其中所述连接子包括SEQ ID NO：1、63
‑
71、144、152或249之一。18.根据权利要求1所述的分离的核酸、根据权利要求2所述的嵌合抗原受体或根据权利要求3所述的递送悬浮液，其中重链位于轻链的N端，并且其中所述重链可变区的序列与SEQ ID NO：119至少90％相同，并且其中所述轻链可变区的序列与SEQ ID NO：122至少90％相同。19.根据权利要求4所述的分离的核酸、嵌合抗原受体或根据权利要求4所述的递送悬浮液，其中重链位于轻链的N端。20.根据权利要求5所述的分离的核酸、根据权利要求5所述的嵌合抗原受体或递送悬浮液，其中重链位于轻链的N端。21.根据权利要求1所述的分离的核酸、根据权利要求2所述的嵌合抗原受体或根据权利要求3所述的递送悬浮液，其中轻链位于重链的N端。22.根据权利要求4所述的分离的核酸、嵌合抗原受体或递送悬浮液，其中轻链位于重链的N端。23.根据权利要求5所述的分离的核酸、嵌合抗原受体或递送悬浮液，其中轻链位于重链的N端。24.根据权利要求1所述的分离的核酸、根据权利要求2所述的嵌合抗原受体或根据权利要求3所述的递送悬浮液，其中所述嵌合抗原受体进一步包括茎结构域和共刺激结构域，
并且其中所述嵌合抗原受体从氨基端到羧基端包括所述ASTR、所述茎结构域、所述跨膜结构域、所述共刺激结构域和所述细胞内激活结构域。25.根据权利要求24所述的分离的核酸、嵌合抗原受体或递送悬浮液，其中所述细胞内激活结构域是CD3Z激活结构域，并且其中所述共刺激结构域是ICΔ共刺激结构域、CD28共刺激结构域、CD137共刺激结构域，或者包括ICΔ共刺激结构域和CD137共刺激结构域两者或CD28共刺激结构域和CD137共刺激结构域两者。26.根据权利要求24所述的分离的核酸、嵌合抗原受体或递送悬浮液，其中所述茎结构域是CD8茎结构域或CD28茎结构域，其中所述跨膜结构域是CD8跨膜结构域或CD28跨膜结构域，其中所述细胞内激活结构域是CD3Z激活结构域，并且其中所述共刺激结构域是CD137共刺激结构域、CD28共刺激结构域或ICΔ共刺激结构域。27.根据权利要求26所述的分离的核酸、嵌合抗原受体或递送悬浮液，其中所述共刺激结构域是CD137共刺激结构域。28.根据权利要求1所述的分离的核酸、根据权利要求2所述的嵌合抗原受体或根据权利要求3所述的递送悬浮液，其中所述CAR进一步包括识别结构域。29.根据权利要求28所述的分离的核酸、嵌合抗原受体或递送悬浮液，其中所述识别结构域由监管机构批准的抗体识别。30.根据权利要求28所述的分离的核酸、嵌合抗原受体或递送悬浮液，其中所述识别结构域是EGFR的至少20个连续氨基酸。31.根据权利要求7所述的分离的核酸、CAR或递送悬浮液，其中所述抗HER2 CAR活性是在与HER2表达性靶细胞一起温育时对T细胞的激活。32.根据权利要求31所述的分离的核酸、CAR或递送悬浮液，其中所述对T细胞的激活是通过分析T细胞对T细胞激活生物标志物的表达增加、T细胞进行的细胞因子产生、T细胞的增殖和T细胞进行的靶细胞杀伤中的一种或多种来确定的，其中所述CAR活性是在体外测定中测量的，其中HER2表达性靶细胞的来源和用根据权利要求1所述的分离的核酸或编码根据权利要求6所述的CAR的分离的核酸转导的被测CAR
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T细胞在测定培养基中一起温育，持续有效执行所述测定的时间。33.根据权利要求1所述的分离的核酸、根据权利要求2所述的CAR或根据权利要求3所述的递送悬浮液，其中：X1、X2、X3和X4的所述组合分别是R、R、D和H，重链可变区肽由核酸序列SEQ ID NO：145编码，并且所述轻链可变区由核酸序列SEQ ID NO：149编码；X1、X2、X3和X4的所述组合分别是R、R、A和D，重链可变区肽由核酸序列SEQ ID NO：145编码，并且所述轻链可变区由核酸序列SEQ ID NO：150编码；或者X1、X2、X3和X4的所述组合分别是R、R、A和E，重链可变区肽由核酸序列SEQ ID NO：145编码，并且所述轻链可变区由核酸序列SEQ ID NO：151编码。34.根据权利要求1所述的分离的核酸、根据权利要求2所述的CAR或根据权利要求3所述的递送悬浮液，其中：X1、X2、X3和X4的所述组合分别是K、R、A和H，所述轻链可变区由SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：格雷戈里，
申请(专利权)人：生物蛋白有限公司，
类型：发明
国别省市：