本发明专利技术涉及鉴定和使用排斥性引导分子（ＲＧＭ）蛋白质家族成员的再生蛋白受体结合结构域及衍生自其的多肽片段。本发明专利技术结构域，即，肽片段，适宜作为药剂用于主动或被动免疫个体以及作为诊断和治疗剂用于起源或进程涉及ＲＧＭ家族成员和该分子的细胞受体的疾病或病理状况。本发明专利技术还涉及抗本发明专利技术结合结构域和抗由其衍生的多肽的单克隆抗体和多克隆抗体，以及制备本发明专利技术结构域、多肽和抗体的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及排斥性引导分子(repulsive guidance molecular, RGM)蛋 白质家族成员的受体结合结构域(receptor binding domain)的鉴定和用 途，并且涉及从其衍生的多肽片段。根据本专利技术的结构域和肽片段适宜作 为主动或被动免疫个体的药剂，并且适宜作为用于疾病或病理状况(其中 在所述疾病或病理状况的t艮或进程当中牵涉RGM家族成员和该分子的 细胞受体)的诊断剂和治疗剂。本专利技术还涉及抗本专利技术结合结构域和抗从 其衍生的多肽的单克隆和多克隆抗体，并且涉及用于制备本专利技术的结构域、 多肽和抗体的方法。
技术介绍
RGM蛋白质家族成员的功能由Monnier， P.P.等，Nature, 419， pp. 392-395, 2002第一次描述。该家族包括目前>^开的三个成员，它们分别称 作RGMA、 RGMB(也称作DRAGON)和RGMC(也称作血幼素 (hemojuvelin扉iederkofler V.等，J. Neurosci. 24， 808-18， 2004)。它们 是通过脂质锚(糖基磷脂酰肌醇锚-GPI锚)结合至质膜的糖蛋白。该蛋白质 家族的成员与其他蛋白质没有任何广泛的序列同源性，并且已经鉴定的结 构特征基本上是如下区域N-末端信号肽；RGD序列；M酸序列GDPH 附近的蛋白水解切割位点；von Willebrand因子结构域(vWF D)的结构同 系物；邻近C末端的疏水序列以及C-末端GPI锚共有序列(还可参见图2)。在人中，RGMA的编码序列位于15号染色体，RGMB的编码序列 位于5号染色体，并且RGM C的编码序列位于1号染色体。观察到特征性表达方式。RGM A和B尤其表达于成人脑和脊髓，RGMC尤其表达于 骨骼肌、肝脏和心肌。RGMB还表达于软骨组织。RGM蛋白质最初作为在神经元拓朴投射形成中起重要作用的候选蛋 白质而被鉴定出来(StahlB.等，Neuron 5:p 735-43， 1990; MudlerB.K. 等，Curr. Biol.6, pp. 1497-1502， 1996; Mueller B.K，《Molecular Basis of Axon Growth and Nerve Pattern Formation》，H. Fujisawa编，Japan Scientific Societies Press, 215-229， 1997)。它们以排斥或抑制方式对生长 的神经纤维产生作用的能力是一项决定性的功能特征，该特征在其分离、 克隆和表征当中起着重要的作用。可以在样品细胞分析试验系统中容易地 检测该活性。RGM蛋白质在两种不同的细胞分析试验中具有抑制或排斥 效应。在塌陷试验(collapse assay)中，RGM蛋白质加入到生长的神经 纤维中。RGM与RGM受体的结合诱导一个由神经元生长锥的所有膜元 件参与的强力反应。由此，最初延伸的手样生长锥转变成细线。在RGM 存在下，神经纤维持继受到抑制、极大回缩并且不再能够继续生长。RGM蛋白质通过结合至RGM受体再生蛋白(Neogenin)发挥其部分 作用(RajagopalanS.等，Nat Cell Biol. 6, pp. 756-62， 2004)。再生蛋白与 DCC(在结直肠癌中缺失(这eleted in ￡olorectal gancer))受体密切相关。两个 受体均M疫球蛋白超家族的成员并且具有细胞外结构域、跨膜结构域和 细胞内结构域。两个受体均被描述为另一配体导蛋白-1的受体，但是只有 再生蛋白，而不是DCC结合RGM蛋白质。这些受体的细胞外结构域由 四个免疫球蛋白样结构域组成，其后是6个纤连蛋白重复结构域。RGMA在神经系统中的功能了解最深，并且特别值得注意的是其在 非常低的浓度时具有抑制神经纤维生长的作用。在成年人类和在成年大鼠 中，中枢神经系统的损伤导致RGM蛋白质在损害部位积累(Schwab J.M. 等，Arch. Neurol.待版，2005; Schwab J.M.等，Eur. J. Neurosci. 21:p. 387-98, 2005)。由此，损伤的神经纤维的重新向外生长(outgrowth)被阻止， 并且发生持久的或多或少严重的功能缺陷(这取决于损害的部位的位置)。 RGM的这种对神经纤维生长的抑制活性通过结合至再生蛋白受体而介导(RajagopalanS.等，见上引文)。然而，同一受体通过结合导蛋白-1也介导 刺激神经纤维生长的相反效应。最新的结果表明，RGM蛋白质还在中枢和周围神经系统中、在调节 铁代谢方面、在肿瘤病中、在炎性过程中以及在骨和软骨组织的形成中起 着重要的作用。基于RGMA、 B和C以高亲和力结合再生蛋白受体的观察，本专利技术 的一个目的是详细表征这些分子、特别是RGM A的功能性结合结构域。 这将使得可以产生抗该结构域的抗体和抗从该结构域衍生的活性RGM肽 的抗体，其中所述的抗体高度可能中和RGM的抑制活性，并且由此可能 刺激神经纤维的再生或重新向外生长。此外，结合结构域或从其衍生的活 性RGM肽本身可以作为治疗有效剂而提供。专利技术简述通过分离和表征人RGM蛋白质、特别是RGM A的结合结构域及其 活性多肽片段，令人惊讶地实现了上述目的。附图简述附图说明图1显示人RGMA(GenBank # NP—064596.1) RGMB(GenBank # NP—001012779)和RGM C(GenBank # NP—998818.1)的序列比对。图2以图表形式显示RGM分子的结构。在N-末端信号肽和C-末端 GPI锚之间显示了 RGD序列、von Willebrand因子结构域(vWF D)和锚区 域之前的C末端区域内的疏7jC序列。根据本专利技术的目的结合结构域区推测 位于vWFD和疏水区之间。表下显示人RGMA中的相应氨基酸位置，蛋 白水解切割位点位于M酸168和169之间。图3A通过焚光显微照片显示不同RGM A肽片段对大鼠神经元细胞 的神经纤维生长的影响。虽然肽l在10ng/ml的浓度时具有抑制活性，但 是相同浓度的肽4是无活性的。显示了相应的与緩冲液或PBS的对照混合 物，用于比较。图3B显示所测量的轴突生长指数(轴突所覆盖的面积相对于细胞聚集物大小的度量；显示了平均值和标准差)的柱形图，以说明本发 明的RGMA肽1的轴突生长抑制活性的浓度依赖性。对于RGMA肽4 的相应的柱形图示于图3C。图4A显示人神经元NTera细胞的荧光显微照片，以说明RGM A肽 1和肽4(每一个的浓度为30照/ml)对这些细胞的神经纤维生长的影响。与 所示的对照图像(与PBS而不是肽孵育)相比，说明只有肽1对神经纤维生 长具有抑制性作用。图4B显示对于用肽1、肽4和对照(PBS)进行的实 验系列相应测量到的轴突生长指数(上图各单独的测量值和平均值，下图 带有平均值和标准差的柱形图)。图5A显示在NTera神经纤维生长分析试验中对RGM A片段的分析 结果。RGM A片段2(218-284)和6(168-422)均以90 nM的浓度加入到Ntera 神经元中。两个片段均强烈地抑制Ntera神经元的神经纤维生长。*** = 相对于本文档来自技高网...
【技术保护点】
排斥性引导分子（ＲＧＭ）的再生蛋白受体结合结构域。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：BK米勒，G舍费尔，R米勒，
申请(专利权)人：阿伯特有限及两合公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]
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