一种新型蛋白质分子定向进化方法技术

本发明专利技术属于生命科学领域，具体涉及一种根据蛋白质分子的空间三维结构或者诸如序列信息、二级结构信息等等其它有用信息，分析其分子特性，理性选择目的突变位点，并进行随机重复递推式基因序列突变，之后通过筛选，获得具有目的特性的新型蛋白质分子的定向进化方法。本发明专利技术的定向进化技术结合了理性过程和随机过程的优势。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生命科学领域，具体涉及一种根据蛋白质分子的空间三 维结构或者如序列信息和二级结构信息等等所有有用的信息，分析其分 子特性，理性选择目的突变位点，并进行随机重复递推式基因序列突变， 之后通过筛选，获得具有目的特性的新型蛋白质分子的定向进化方法。
技术介绍
荷兰科学家格里特于1838年首次发现蛋白质，蛋白质是生物体内一 种极为重要的高分子有机物，凡是有生命的物质离开蛋白质就无法生存。 蛋白质的基本组成单位是氨基酸，氨基酸通过脱水缩合形成肽链。蛋白 质是由一条或多条多肽链组成的，每一条多肽链有十几个至数百个不等 的氨基酸残基，各种氨基酸残基按一定的顺序排列。蛋白质是生命的体 现者，现代生物工程技术的发展，使得人类可以获得离体的、纯化的、 并具有生物活性的蛋白质，可用于生物医药和生物催化等等领域。可是， 生物体内天然存在的蛋白质，其特性往往不尽人意，将其提取出来，并 在体外使用时常常具有很多缺点,比如活性低，对高温、低温、髙PH、 低pH、高压、辐射等等极端环境的耐受性差。因此需要对其进行人工的 分子改造，使合成的蛋白质更符合人类的需要。由于每一种蛋白质都有 自己独特的氨基酸排列顺序(一级结构)，所以只要改变其中关键的氨基 酸序列就能改变蛋白质的性质。而氨基酸又是由核酸序列上的三联体密 码子决定的，因此只要改变构成遗传密码的碱基序列就能达到改造蛋白 质的目的。这一技术始于20世纪90年代，称为定向进化技术(Directed evolution),其中运用最为广泛的实际操作方法为错误倾向PCR (Error-prone PCR)和DNA改组(DNA shuffling )。其核心思想是随机 地改变编码蛋白质的基因序列，获得文库，然后通过大量的筛选，从文 库中获得正向进化的目的基因。但是此类方法的随机性很大，其成败与 否和效果优劣在于筛选量的大小和准确性。数十年前，人类已知蛋白质分子的理化特性和生物学活性直接取决于其空间三维结构，而根据蛋白 质分子的空间三维结构，可以分析出蛋白质的生物活性和某一理化特性具体和哪些氨基酸残基相关联。随着现代结构生物学技术的发展，使用x射线衍射法和NMR法等方法，人类已经获得了很多蛋白质分子的空间三 维结构，但是由于自然界存在的蛋白质分子种类众多，而通过实验方法 解析蛋白质分子的空间三维结构费用高，步骤繁杂，难度较大，因此， 通过实验方法得到空间结构的蛋白质分子的数量所占比例比较少。而近 几年，通过使用生物信息学的方法，借助计算机技术，人工模拟蛋白质 分子空间三维结构取得了很大的进展。基于人工模拟的空间三维结构或 者实验方法解析出的空间三维结构，分析出蛋白质分子中可能与某一特 性相联系的氨基酸残基的位置，并理性选择这些位置，对基因进行突变， 可以提高正向进化的效率，减小筛选压力。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过使用X射线衍射法、NMR法等等实验方法解析蛋 白质分子的空间结构。或者使用计算机技术，根据蛋白质分子的序列信 息，模拟其空间三维结构。进而根据得到的三维结构信息或者其它信息， 分析其分子特性，理性选择目的突变位点，并进行随机重复递推式基因 序列突变，之后通过筛选，获得具有目的特性的新型蛋白质分子。本发 明的定向进化技术结合了理性过程和随机过程的优势，其具体步骤如下1.获得蛋白质分子的核酸序列和氨基酸序列通过使用基因工程学原理，用PCR法或者文库法等等方法，得到目的 蛋白质分子的基因片段，然后再使用"酶切"、"连接"、"转化"等等实 验技术，将目的基因片段连上载体，导入宿主菌并保存。之后对基因进 行测序，获得基因的碱基序列，根据三联密码子，可以由基因序列转换 得到氨基酸序列。或者通过搜索Genbank、 EMBL、 DDBJ等等国际序列数 据库，获得目的蛋白质分子的核酸序列和氨基酸序列，使用全基因合成 法，合成目的基因(如果该序列信息受到专利保护，应事先获得专利所有者的授权)。2.获得三维结构信息目的蛋白质分子的三维结构信息可以通过实验法和计算机辅助模拟 法得到。实验法包括X射线晶体衍射法和NMR法。X射线衍射分析主要是根据 衍射线的方向和强度，即衍射图案上斑点的位置和黑度，通过电子计算 机，绘制出电子密度图，从中构建出三维分子图像。NMR分析的原理是 处于一个静磁场中的核子会由于磁场的作用而处于不同的能量状态，当 一个外界的摆动的磁场来扰动处于"平衡"状态的核子时，吸收了能量 的核子就会在不同的能级之间跃迁，并在此过程中释放出能量。而放出 的能量被检测到之后，经过分析和计算就可以得到蛋白质分子内部的结 构信息。计算机辅助构建蛋白质三维模拟结构基于生物信息学中的蛋白质结 构预测技术，其主要有两大类方法。 一类是理论分析方法或从头算法， 通过理论计算(如分子力学、分子动力学计算)进行结构预测。另一类 蛋白质结构预测的方法是统计方法，该类方法对已知结构的蛋白质进行 统计分析，建立序列到结构的映射模型，进而根据映射模型对未知结构 的蛋白质直接从氨基酸序列预测结构。这一类方法包括经验性方法、结 构规律提取方法、同源模型化方法等等。同源模型化方法最为常用，预 测效果也最为可靠，其原理基于具有相似序列的蛋白质倾向于折叠成 相似的空间三维结构。 一对蛋白质，如果它们的序列具有25%-30%的等同 部分或者更多，则可以假设这两个蛋白质折叠成相似的空间结构。这样， 如果一个未知结构的蛋白质与一个已知结构的蛋白质具有足够的序列相 似性，那么可以根据相似性原理给未知结构的蛋白质构造一个近似的三 维模型。通过使用生物信息学的计算机软件(如ACCELRYS DISCOVERY STUDIO, SYBYL等等)以及一些生物信息学网络数据库(如pdb, Swiss-model等 等)，可以模拟出目的蛋白质分子的空间三维结构。 3. 根据三维模型和序列信息或者其它信息选择合适的突变位点本专利技术中的"突变位点"定义为既可以是蛋白质分子上的一个单氨 基酸残基，也可以是包含有多个氨基酸残基的序列区域以及它们所对应的 DM和RNA上的单个碱基位点和多个碱基组成的序列区域(下同)。"突变位点"的选择既可以根据蛋白质分子三维结构信息，也可以根据诸如序列 信息、二级结构信息等等所有有用的信息。4. 对突变位点进行定点突变在确定了突变位点之后，可以对编码蛋白质的DM序列或RNA序列进 行改造。对于待突变位点，既可以将其代表某一氨基酸的三联密码子更 换为代表另一氨基酸的三联密码子，也可以使用随机密码子，即在之 后的转录并翻译成蛋白质分子的过程中，在使用随机密码子的位置处， 加入多肽链的氨基酸的种类是随机的。这样，就可以构建成一个随机序 列文库，其特点在于在理性选择的突变位点处产生了随机的序列信息。对序列上的特定位点进行改造的常用方法包括重叠延伸PCR法和大 引物PCR定点突变法、全基因合成法合成包含特定突变的全序列、限制 性内切酶切除待突变区域后使用连接酶加入目的突变序列等等。5. 筛选目的克隆对于"将其代表某一氨基酸的三联密码子更换为代表另一氨基酸的三 联密码子"这一情况(该情况简称"非随机情况"，下同)，可以直接将 改造后的序列连上表达载体，转化宿主菌，表达出目的蛋白，并直接对 目的蛋白的活性和理化特性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新型的蛋白质分子定向进化方法，其主要流程是：通过使用Ｘ射线衍射法、ＮＭＲ法等等实验方法解析作为进化起点的蛋白质分子的空间结构。或者使用计算机技术，根据蛋白质分子的序列信息，模拟其空间三维结构。进而根据得到的三维结构信息，或者根据该蛋白质分子的其它信息（如序列信息、二级结构信息等等所有有用的信息），分析其分子特性，理性选择目的突变位点，并进行随机重复递推式基因序列突变，之后通过筛选，获得具有目的特性的新型蛋白质分子。其主要特征是：结合了理性过程和随机过程的优势。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：林峻，
申请(专利权)人：林峻，
类型：发明
国别省市：35[中国|福建]