一种分子量内标及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种分子量内标及其制备方法和应用，所述内标的上游引物为SEQ ID NO:1，下游引物包括SEQ ID NO:2～35。与现有技术相比，本发明专利技术具有以下优点：(1)本发明专利技术所述分子量内标分辨率高，校准能力强，且偏差小；(2)扩增效率高，且结果精确；(3)分子量内标的生产成本低，适应于大规模的生产制备；(4)所述分子量内标应用范围广，可应用于不同的遗传分析仪及胶中。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，涉及法医DNA分型、DNA测序、SNP检测、核糖体分型或PAGE电泳的应用领域，具体涉及一种以改造后的质粒为模板扩增获得的分子量内标，以及该分子量内标的具体制备方法和应用。
技术介绍
毛细管电泳具有多种分离模式，因其介质和原理的不同故具有多种功能，因此其应用十分广泛，小到无机离子，大到生物大分子和超分子，都可进行分离检测。广泛应用于生命科学、分子生物学、法庭与侦破鉴定、化学等领域。检测DNA分子用到的毛细管电泳的分离机制是在毛细管中灌注一定浓度的黏性多聚溶液，如ABI遗传分析仪器上所用的POP4、POP6、POP7等，聚合物具有一定的孔径状的筛网状结构，起到了分子筛的作用，较大的DNA分子受到这种聚合物的阻滞作用大于小片段的DNA分子。变性的DNA片段在此聚合物中迁移与分子量表现了良好的线性关系，可以精确到1个碱基的差别。DNA片段长度分析广泛应用于测序、SNP检测、法医DNA分型、核糖体分型等方面。15年我国已启动精准医学计划，预计在2030年前投入600亿元，2016年精准医学被列入“十三五规划”，基因测序作为精准医学的核心技术，其地位不言而喻。二代测序成为成熟技术，第三代测序发展迅猛的今天，一代测序依然有它存在的重要意义，其读长长，费用低，并因引入突变率低的特点依然是检测突变位点的金标准。法医DNA分型中的STR基因座已经建立大规模的法医DNA数据库，为司法实践中的案件侦破和审判，提供了强有力的支持。电泳如果没有DNA标准物的比较，凝胶中DNA带位置是没有意义的。分子量内标是含一系列已知片段长度的荧光标记的DNA片段，根据电泳后的片段迁移与片段大小关系，构建一个二阶曲线，未知大小的DNA扩增片段可以通过此曲线计算出片段大小。分子量内标属于内对照，而传统的分子量标准属于外对照，内对照与待测样品在同一毛细管道电泳，两者的电泳环境完全一致，因此校对结果更加准确。市面上广泛存在的分子量内标中，以ABI的liz500最多，其包括14个片段。ABI3130或者3500遗传分析仪中分子量大小计算多以调用localsouthernmethod，这种计算模式以目的片段的大小，以前面两个内标分子做出的曲线计算值和后面两个内标分子做曲线计算值的平均值为样本的最终片段大小。因而片段数量直接影响DNA片段长度计算的精确性。以liz500为例，200bp-300bp之间只有一个片段作为指示性质的内标片段，并无参与计算的内标片段，在有明显的电泳条件改变情况下，比如胶或buffer过期、电泳环境过高等极端情况下，极易出现DNA片段长度计算不正确的情况，会出现0.5bp以上差异。相应增加分子量内标片段，可使分辨率更高，矫正能力更强。
技术实现思路
解决的技术问题：为了克服现有技术的缺陷，获得一种偏差小，扩增效率高，具有精准校准能力的分子量内标，本专利技术提供了一种分子量内标及其制备方法和应用。技术方案：一种分子量内标，所述内标的上游引物为SEQIDNO:1，下游引物包括SEQIDNO:2～35。优选的，所述内标的上游引物采用荧光标记，标记物为FAM、HEX、TAMRA、ROX、VIC、PET、NED、TAZ或SIZ荧光染料。优选的，所述内标的引物扩增产生34个片段，片段长度分别为60bp、80bp、100bp、114bp、120bp、140bp、160bp、180bp、200bp、214bp、220bp、240bp、250bp、260bp、280bp、300bp、314bp、320bp、340bp、360bp、380bp、400bp、412bp、420bp、440bp、460bp、480bp、500bp、514bp、520bp、540bp、560bp、580bp、600bp。所述引物的序列如表1和表2所示：表1分子量内标的上游引物编号上游引物序列5'-3'端SEQIDNO:1CTGCAAGGCGATTAAGTTGG表2分子量内标的下游引物一种分子量内标的制备方法，包含以下步骤：(1)分子量内标引物设计a.在pMD-18质粒中插入一段600bp的序列，该序列为ATCG含量均一的人工合成片段，以上述人工改造的质粒作为模板，固定上游引物，采用荧光染料FAM、HEX、TAMRA、ROX、VIC、PET、NED、TAZ或SIZ标记上游引物；采用oligo7软件分析改造的质粒全序列。b.根据所需扩增片段的长度，设计下游引物，对下游引物的5'端进行改造；上下游引物设计过程中遵循引物设计原则，如GC含量在40～60％之间、避免复杂二级结构、避免发卡结构、引物间避免产生二聚体等，以引物Tm值均一、高特异性和避免引物内部及引物间的二级结构为主；调整引物的5’端碱基减少二级结构，以达到更高的扩增效率。(2)分子量内标迁移调整DNA中的碱基分子量分别为胞嘧啶(C)289.18、鸟嘌呤(G)329.21、腺嘌呤(A)313.21、胸腺嘧啶(T)304.19。在步骤(1)对下游引物5'端的碱基进行改造的基础上，因AGCT四种碱基对迁移率的影响为C>T>A>G，根据片段迁移的实际结果对下游引物的5'端进一步调整；(3)分子量内标准确度评价毛细管电泳仪器有310，3100，3130，3500，3730等，使用的胶有POP4,POP6，POP7，由于不同仪器的差别以及胶的区别对内标分子的迁移有较大的影响，需要调整引物去测试上述各种环境，这也加大了引物设计的难度和测试难度，分子量内标的准确度采用以下方式评价：a.用内标分析等位基因ladder的片断大小，重复上样16次，分析ladder中每个位点的每个基因型的数值，取平均数并计算标准偏差SD，SD小于0.1nt，且用GeneMapper分析，Sizecallingcurve中的bestfitsecondordercurve的R2>0.99999；b.采用等位基因阶梯和实际样本来检验分子量内标，以liz500作为对照，同批次检测，用内标分析等位基因ladder的片断大小，重复上样16次，分析ladder中每个位点的每个基因型的数值，取平均数并计算标准偏差SD，SD值小于0.1nt，分子量内标合格。所述分子量内标经过电泳分离后用来分析同一泳道中的目的DNA片段大小。在使用过程中，需低温保存，且避免反复冻融。所述的一种分子量内标在法医DNA分型、DNA测序、SNP检测、核糖体分型中的应用。优选的，所述分子量内标的应用体系为25.0μL，具体如下：Buffer4μL，改造后的质粒0.5μL，上游引物0.3μL，下游引物0.3μL，Taq酶0.5Μl,sdH2O补足至25.0μL；所述Buffer的组分为：MgCl27.5mM,Tris-HClBuffer125mM,KCl125mM,dNTPs7.5mM；所述改造后的质粒中DNA的含量为0.125～5ng。优选，所述应用的程序为初始变性：95℃，2分钟；热循环：94℃30秒，60℃30秒，72℃60秒，共进行30个循环；终延伸：72℃，10分钟；保温：4℃。所述的一种分子量内标在PAGE电泳中的应用。有益效果：(1)本专利技术所述分子量内标分辨率高，校准能力强，且偏差小；(2)扩增效率高，且结果精确；(3)分子量内标的生本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分子量内标，其特征在于，所述内标的上游引物为SEQ ID NO:1，下游引物包括SEQ ID NO:2～35。

【技术特征摘要】
1.一种分子量内标，其特征在于，所述内标的上游引物为SEQIDNO:1，下游引物包括SEQIDNO:2～35。2.根据权利要求1所述的一种分子量内标，其特征在于，所述内标的上游引物采用荧光标记，标记物为FAM、HEX、TAMRA、ROX、VIC、PET、NED、TAZ或SIZ荧光染料。3.根据权利要求1或2所述的一种分子量内标，其特征在于，所述内标的引物扩增产生34个片段，片段长度分别为60bp、80bp、100bp、114bp、120bp、140bp、160bp、180bp、200bp、214bp、220bp、240bp、250bp、260bp、280bp、300bp、314bp、320bp、340bp、360bp、380bp、400bp、412bp、420bp、440bp、460bp、480bp、500bp、514bp、520bp、540bp、560bp、580bp、600bp。4.权利要求1或2所述的一种分子量内标的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)分子量内标引物设计a.在pMD-18质粒中插入一段600bp的序列，该序列为ATCG含量均一的人工合成片段，以上述人工改造的质粒作为模板，固定上游引物，采用荧光染料FAM、HEX、TAMRA、ROX、VIC、PET、NED、TAZ或SIZ标记上游引物；b.根据所需扩增片段的长度，设计下游引物，对下游引物的5'端进行改造；(2)分子量内标迁移调整在步骤(1)对下游引物5'端的碱基进行改造的基础上，因AGCT四种碱基对迁移率的影响为C>T>A>G，根据片段迁移的实际结果...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑卫国，陈林丽，高智勇，王艳芳，张雷，郭育林，
申请(专利权)人：无锡中德美联生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32