一种标准分子量片段混合物的制备方法及由其制备的标准分子量片段混合物。所述标准分子量片段混合物的制备方法包括，所述标准分子量片段混合物包括1个80bp大小的SEQ ID No.1所示片段和其余9个片段，所述9个片段的大小分别为124bp、194bp、224bp、254bp、304bp、349bp、399bp、424bp和454bp，其中，所述9个片段分两部分进行制备，首先以pMD18‑T质粒载体作为模板，获得所述9个片段的第一部分，然后将各片段的第一部分分别与作为第二部分的带荧光接头连接获得所述9个片段。本发明专利技术提供的标准分子量片段混合物可用于毛细管电泳测定DNA序列大小，具有制备简单，成本低，实用性强，检测准确灵敏等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及DNA分型
，尤其涉及一种标准分子量片段混合物的制备方法及由其制备的标准分子量片段混合物。
技术介绍
法医DNA分型技术自问世以来，在法医学领域引起革命性的变革，极大地提高了执法部门根据现场证据搜集罪犯的能力。DNA遗传标记具有不随年龄、营养状况或环境变化而改变等特点，利用毛细管电泳检测DNA遗传标记，进而确定DNA分型的方法被广泛应用。在毛细管电泳实验中，标准分子量片段混合物作为内标物，定量加入到待测样品DNA中，即可根据内标物的分子量推定待分型DNA的片段大小。标准分子量片段混合物是一组带有荧光标记的、已知分子量大小的、较纯的DNA片段混合物。与传统DNA分子量标准物(Marker)相比，首先，内标作为内对照，其本身带有荧光标记，与待测样品在同一毛细管中检测，校对计算结果更加准确。其次，遗传分析仪所用的电泳介质是毛细管电泳的流胶，分辨率可精确到1个bp，较琼脂糖凝胶分辨率(几十个bp)提高了几十倍，因此其精确度也更高。利用单一DNA片段的PCR扩增虽然方法简单，但是利用同一对引物对同一片段进行反复的PCR扩增,有时重复性差，各种PCR产物在混合时相互稀释,有时候需要浓缩才能够达到较好的浓度标准，需要较高的人力和资金投入。多重PCR产物的扩增的方法，即利用一对或几对引物在同一反应管内对一个或多个模板进行扩增,获得一组PCR产物,但是由于多重引物的相互影响，PCR效率低，重复性差，很难实现内标的大量生产。如何提供一种具有制备简单、成本低、易于保存、实用性强、检测灵敏、定量快速等优点的标准分子量片段混合物成为有待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术提供一种标准分子量片段混合物的制备方法，通过将标准分子量片段分两步进行制备，制备过程简单，并能显著降低制备成本。本专利技术还提供了一种标准分子量片段混合物，由所述方法制备，具有易于保存、实用性强、检测方便的特点。本专利技术还提供了一种试剂盒，包括所述的标准分子量片段混合物，所述试剂盒能有效的检测DNA分子大小。本专利技术提供的一种标准分子量片段混合物的制备方法，其中，所述标准分子量片段混合物包括1个80bp大小的SEQIDNo.1所示片段和其余9个片段，所述9个片段的大小分别为124bp、194bp、224bp、254bp、304bp、349bp、399bp、424bp和454bp，其中，所述9个片段分两部分进行制备，首先以pMD18-T质粒载体作为模板，利用针对以上9个片段的扩增引物对所述模板分别进行PCR扩增获得9个片段的扩增序列，将所述扩增序列酶切后获得9个目标片段，然后将各目标片段分别插入质粒载体获得9个重组质粒，并将各重组质粒分别转入宿主细胞进行增殖，之后回收各重组质粒并酶切获得所述9个片段的第一部分，所述扩增引物为SEQIDNo.2至SEQIDNo.19所示的核苷酸序列，然后将各片段的第一部分分别与作为第二部分的带荧光接头连接获得所述9个片段。在本专利技术的方案中，所述SEQIDNo.1可以通过人工合成获得。SEQIDNo.1的序列为：GAGCATGTCGTGACGTCAGAATTCTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCG。本专利技术提供的9对扩增引物及其相对应的标准分子量片段如下表1所示，PCRF代表正向引物，PCRR代表反向引物；在本专利技术的一个具体实施方式中，所述第一部分与所述第二部分通过粘性末端连接。在本专利技术的另一个具体实施方式中，插入目标片段的质粒载体为pMD18-T质粒载体，所述酶切为EcolRΙ和SalΙ双酶酶切。在本专利技术的方案中，所述酶切包括对所述扩增序列的酶切，对重组质粒的酶切等。在本专利技术的另一个具体实施方式中，作为第二部分的带荧光接头由两条互补的DNA序列构成，所述DNA序列为SEQIDNo.20和SEQIDNo.21所示的序列，所述带荧光接头的不互补端为EcolRΙ粘性末端，所述带荧光接头的另一端的一条DNA链末端带有荧光标记物。例如，所述带荧光接头可以为：片段大小序列SEQIDNO.修饰19bpGAGCATGTCGTGACGTCAGSEQIDNo.205’荧光标记物23bpCTCGTACAGCACTGCAGTCTTAASEQIDNo.21无进一步的，所述荧光标记物位于SEQIDNo.20的5’端，所述荧光标记物为ROX。进一步的，所述宿主细胞为JM109大肠杆菌细胞。更进一步的，所述第二部分与各片段的第一部分的连接条件为：第二部分与各片段的第一部分的摩尔比为3:1，连接温度为37℃，连接时间为30min，然后升温至95℃，5min终止连接反应。更进一步的，将pMD18-T载体1963bp处至2391bp的序列作为模板来使用所述扩增引物进行扩增。申请人研究发现使用这段序列GC比例适中，无特殊二级结构，有利于稳定的获得上述片段。本专利技术提供的一种标准分子量片段混合物，所述标准分子量片段混合物所述方法获得。本专利技术还提供了一种试剂盒，含有所述的标准分子量片段混合物。本专利技术提供的方案具有以下突出的优点：1)本专利技术提供一种标准分子量片段混合物的制备方法，解决了利用单一DNA片段的PCR扩增虽然方法简单，但是利用同一对引物对同一片段进行反复的PCR扩增,有时重复性差，各种PCR产物在混合时相互稀释，有时候需要浓缩才能够达到较好的浓度标准，需要较高的人力和资金投入的难题。2)同时也解决了多重PCR产物的扩增的方法，即利用一对或几对引物在同一反应管内对一个或多个模板进行扩增,获得一组PCR产物,但是由于多重引物的相互影响，PCR效率低，重复性差，很难实现内标的大量生产的问题。3)本专利技术方案将标准分子量片段分两步进行制备，利用将所述第一部分插入质粒载体，并在宿主体内大量扩增带有所述第一部分的重组质粒，一批次实验制备的质粒量远远大于作为仅通过PCR扩增可获得的量，仅需要人工合成较短的第二部分，使用时通过酶切重组质粒获得大量所述第一部分与所述第二部分连接即可，后期不需要DNA聚合酶和PCR缓冲液，并且需要的设备简单，极大地降低了制备成本。重组质粒的易保存性和稳定性，也使得标准分子量片段稳定且易重复，确保了制备的标准分子量片段不仅仅在长度上稳定，同时在碱基序列层面上也相对稳定，保证了其作为毛细管电泳时做标准分子量片段标定目标DNA分子长度的准确性。附图说明图1显示了本专利技术的标准分子量片段混合物的毛细管电泳检测结果；图2显示了9947A标准DNA以本申请制备的标准分子量片段混合物作为参照物的毛细管电泳分型结果；图3显示了9948标准DNA以本申请制备的标准分子量片段混合物作为参照物的毛细管电泳分型结果。具体实施方式实施例1标准分子量片段混合物的制备本实施例中使用的pMD18-T质粒载体购自Takara公司，产品目录号6011；EcolRΙ和SalΙ酶购自Takara公司，产品目录号分别为：EcolRΙ为1040S，SalΙ为1080S；缓冲液以及其他反应试剂也可商购获得。本实施例中的标准分子量片段混合物包括1个80bp大小的SEQIDNo.1所示片段和其余9个片段，所述9个片段的大小分别为124bp、194bp、224bp、254bp、304bp、349bp、399bp、424b本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种标准分子量片段混合物的制备方法，其特征在于，所述标准分子量片段混合物包括1个80bp大小的SEQ ID No.1所示片段和其余9个片段，所述9个片段的大小分别为124bp、194bp、224bp、254bp、304bp、349bp、399bp、424bp和454bp，其中，所述9个片段分两部分进行制备，首先以pMD18‑T质粒载体作为模板，利用针对以上9个片段的扩增引物对所述模板分别进行PCR扩增获得9个片段的扩增序列，将所述扩增序列酶切后获得9个目标片段，然后将各目标片段分别插入质粒载体获得9个重组质粒，并将各重组质粒分别转入宿主细胞进行增殖，之后回收各重组质粒并酶切获得所述9个片段的第一部分，所述扩增引物为SEQ ID No.2至SEQ ID No.19所示的核苷酸序列，然后将各片段的第一部分分别与作为第二部分的带荧光接头连接获得所述9个片段。
【技术特征摘要】
1.一种标准分子量片段混合物的制备方法，其特征在于，所述标准分子量片段混合物包括1个80bp大小的SEQIDNo.1所示片段和其余9个片段，所述9个片段的大小分别为124bp、194bp、224bp、254bp、304bp、349bp、399bp、424bp和454bp，其中，所述9个片段分两部分进行制备，首先以pMD18-T质粒载体作为模板，利用针对以上9个片段的扩增引物对所述模板分别进行PCR扩增获得9个片段的扩增序列，将所述扩增序列酶切后获得9个目标片段，然后将各目标片段分别插入质粒载体获得9个重组质粒，并将各重组质粒分别转入宿主细胞进行增殖，之后回收各重组质粒并酶切获得所述9个片段的第一部分，所述扩增引物为SEQIDNo.2至SEQIDNo.19所示的核苷酸序列，然后将各片段的第一部分分别与作为第二部分的带荧光接头连接获得所述9个片段。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一部分与所述第二部分通过粘性末端连接。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，插入目标片段的质粒载体为pMD18-T质粒载体，所述酶切为EcolRΙ和SalΙ双酶酶切。4....
【专利技术属性】
技术研发人员：王乐，马温华，白雪，张建，莫晓婷，姚伊人，叶健，赵兴春，陈曼，
申请(专利权)人：公安部物证鉴定中心，
类型：发明
国别省市：北京;11
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