本发明专利技术公开了一种制备DL2000?DNA分子量标准的方法，其特征在于，采用质粒酶切法，包括以下步骤：(1)DL2000?DNA分子量标准包括6个DNA片段：100bp，250bp，500bp，750bp，1kb，2kb，将该6个片段分配到两个载体中进行扩增：载体1中包含片段100bp，拷贝数10；片段250bp，拷贝数4；片段500bp，拷贝数2；片段750bp，拷贝数1；和片段1kb，拷贝数1；载体2中包含2kb，拷贝数1；和片段750bp，拷贝数4；(2)将载体1和载体2用限制性内切酶进行酶切，然后混合，即得。本发明专利技术最终得到的产品中各条带亮度均一，生产方便，便于大规模生产，各批次质量稳定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域，特别涉及一种制备DL2000DNA分子量标准的方法及其产品和应用。
技术介绍
DNA分子量标准俗称DNA Marker，是由一系列已知长度的DNA片段混合而成，是分子生物学实验中最常用的一种试剂。通过将实验中所得的DNA片段与DNA Marker在同一块琼脂糖凝胶中进行电泳，通过将样品片段与DNA Marker比较，就可以大致估计出实验所得的DNA片段的大小。DNA Marker的各条带通常有两种制备方案PCR扩增和酶切质粒。PCR扩增的方案就是设计多套PCR引物进行扩增，得到相应大小的DNA片段。然后再对各片段进行纯化，定量。最后按比例将各片段混合，就得到了所需的产品。PCR扩增法制备DNA Marker存在着较大的缺陷，一是扩增的体积会有一定的限制。现在的PCR仪每个孔最多扩增体积不会超过70微升，以一台PCR仪96孔为例，最多一次可以扩增7毫升。更大的量就需要增加PCR仪及进行多次扩增。二是PCR扩增受多种条件影响较大，如仪器，模板，扩增用酶，不同批次的引物，及其他试剂，因此不同扩增批次之间差异会较大。三是PCR 扩增的成功率相对较低，有较多的时间所扩增的条带可能有杂带，或目标条带专一性不太强，所扩增的条带较宽，或扩增产率较低，以及其他的不成功情况。常规质粒酶切的方法，由于DNA的条带亮度与其大小有正比例关系，在一个质粒中各片段酶切后其亮度可能会有较大差异，大片段比小片段亮。因此会导致所制备的终产品各条带之间亮度不均勻。DNA分子量标准是分子生物学实验室中最常用的一种试剂，而且属于消耗型的产品，市场用量很大。而DL2000类型的DNA分子量标准，由IOObp，250bp, 500bp, 750bp (加亮作为指示带)，lkb，2kb共6条DNA片段组成。它是实验室中用得最方便，也是使用最多的一种产品，消耗量很大。许多公司都有类似的产品出售。由于该DNA分子量标准中包含了小片段DNA，许多公司均采用PCR的方案进行产品制备。由于PCR生产中需要消耗大量人力资源及PCR仪，而且像IOObp这种很小的DNA片段采用PCR扩增的方案效率特别低，扩增后的每个条带均需要进行纯化，并定量。然后再逐条带进行配制调整，得到最终产物。因而 PCR扩增中不同批次之间会存在较大差别，并且很耗费人力及试剂，生产流程难于标准化。
技术实现思路
本专利技术针对现有的DL2000DNA分子量标准的制备方法过程烦琐，批次之间质量不稳定，难以大规模生产的不足，提供一种新的制备DL2000类型的DNA分子量标准的方法及其产品和应用，其生产方便，可大规模生产，各批次之间质量稳定，DL2000 DNA分子量标准的各条件亮度均一。本专利技术通过下述技术方案解决了上述问题本专利技术的第一技术方案是一种制备DL2000 DNA分子量标准的方法，采用质粒酶切法，包括以下步骤(1)DL2000 DNA分子量标准包括6个DNA片段lOObp，250bp，500bp， 750bp，lkb，2kb，将该6个片段分配到两个载体中进行扩增，并且使它们在载体中具有特定的拷贝数，其中该6个片段的分配和拷贝数具体如下载体1中包含片段lOObp，拷贝数10 ； 片段250bp，拷贝数4 ；片段500bp，拷贝数2 ；片段750bp，拷贝数1 ；和片段lkb，拷贝数1 ； 载体2中包含2kb，拷贝数1 ；和片段750bp，拷贝数4 ； (2)将载体1和载体2用限制性内切酶进行酶切，然后混合，即得。其中，步骤(1)中可以采取本领域常规的质粒酶切方法，使载体中包含各拷贝数的DNA片段，DNA片段之间是限制性内切酶酶切位点。当载体扩增后，用限制性内切酶酶切载体，即得到各拷贝数的DNA片段。将这些片段混合，即得本专利技术的DL2000 DNA分子量标准。其中，使用的载体可以是本领域常规载体，如质粒等。所述的载体1较佳的是基因工程质粒pTZ19R-250，核苷酸如序列表中SEQ ID NO 3所示；载体2较佳的是基因工程质粒 pUCSl-2k-750,核苷酸如序列表中 SEQ ID NO 4 所示。pTZ19R_250 和 pUCSl_2k_750 中 DNA 片段之间的酶切位点是Hind III。也可以是其他本领域常用的酶切位点，优选Hind III。 将pTZ19R-250和pUCSl-2k-750分别用内切酶Hind III进行酶切；然后，pTZ19R-250和 pUCSl-2k-750的酶切产物经电泳检测合格后，采用亲和柱层析法进行纯化，再进行混合，混合比例较佳的是以PTZ19R-250和pUCSl-2k-750两质粒质量比为2. 5 1 1. 5 1，最佳的为1.9 1。以1.9 1的量进行混合，可保证Ikb的条带的浓度与2kb的条带的浓度相寸。本专利技术的第二技术方案是由上述本专利技术的方法制备的DL2000 DNA分子量标准。本专利技术的第三技术方案是如上所述的本专利技术的DL2000 DNA分子量标准的应用， 一般用于琼脂糖凝胶电泳。本专利技术的第四技术方案是一种基因工程质粒PTZ19R-250，核苷酸如序列表中 SEQ ID NO 1 所示。本专利技术的第五技术方案是一种基因工程质粒pUCSl-2k_750，核苷酸如序列表中 SEQ ID NO 2 所示。本专利技术的要点及优势如下1、构建特殊的质粒，将其中的各条带做相应的拷贝调整，使之相互之间浓度更合理。所提取的质粒经酶切后直接就得到了每条DNA片段所需要的比例，不必像PCR所得的各条带之间还需要仔细进行浓度调整。2、将PCR的工作转化成DNA质粒的提取和DNA的酶切操作。这样的转化，在实际生产中便于生产的标准化和规模的扩大化，PCR扩增限于每次扩增的体积及各扩增批次之间的较大差异，失败率较高，不容易规模化及扩大化。3、由于质粒提取及酶切操作是非常成熟的分子生物学操作，而且非常容易扩大规模，并进行标准的质量控制，因此本专利技术可以大批量进行DNA分子量标准的生产，并保证各批次之间具有几乎完全一致质量标准。附图说明以下结合附图说明本专利技术的特征和有益效果。图1是pTZ19R-250载体构建流程图。图2是pUCSl-2k_750载体构建流程图。图3是pTZ19R-250载体结构图。图4是pUCSl-2k_750载体结构图。图5是本专利技术DL2000 DNA分子量标准产品的1. 2 %琼脂糖电泳图。具体实施例方式本专利技术人将DL2000 DNA分子量标准中包含的6个长度不同的DNA片段分别构建于两个载体中，该两载体扩增后直接用限制性酶切，将酶切产物混合后，就得到了由该6个不同长度DNA片段组成的DL2000 DNA分子量标准，并且仅仅只要调整两质粒的混合比例， 就能使得到的DL2000 DNA分子量标准的5条带亮度一致，指示带(750bp)亮度为其它带的两倍，在电泳中清楚的显示每条带。具体实施方式如下1、两个载体DNA的构建a)总述本专利技术中两个载体均以产量非常高的商品载体pTZ19R(购自Fermentas life sciences,目录编号SD0141)为基础，采用常规的实验方法，进行适当的点突变操作，并从Lambda DNA上扩增适当的片段，作系列的点突变构建基本片段。然后将基本片段与突变改造的载体相连构建最终载体。本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种制备ＤＬ２０００ ＤＮＡ分子量标准的方法，其特征在于，采用质粒酶切法，包括以下步骤：（１）ＤＬ２０００ＤＮＡ分子量标准包括６个ＤＮＡ片段：１００ｂｐ，２５０ｂｐ，５００ｂｐ，７５０ｂｐ，１ｋｂ，２ｋｂ，将该６个片段分配到两个载体中进行扩增，并且使它们在载体中具有特定的拷贝数，其中该６个片段的分配和拷贝数具体如下：载体１中包含片段１００ｂｐ，拷贝数１０；片段２５０ｂｐ，拷贝数４；片段５００ｂｐ，拷贝数２；片段７５０ｂｐ，拷贝数１；和片段１ｋｂ，拷贝数１；载体２中包含２ｋｂ，拷贝数１；和片段７５０ｂｐ，拷贝数４；（２）将载体１和载体２用限制性内切酶进行酶切，然后混合，即得。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赫英俊，孙兰菊，严引娣，
申请(专利权)人：上海捷瑞生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：31
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