一种快速提取革兰氏阳性菌基因组DNA的方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种快速提取革兰氏阳性菌基因组DNA的方法和试剂盒。使用本方法和试剂盒能够在10分钟内快速、高效地提取革兰氏阳性菌基因组DNA，同时提取得到的基因组DNA无需进一步纯化，能直接用于分子检测实验。本方法和试剂盒具有快速、简便、高效、低成本、通用性好等优点，适用于大量革兰氏阳性菌基因组DNA的提取。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体地，涉及一种快速提取革兰氏阳性菌基因组DNA的方法和一种快速提取革兰氏阳性菌基因组DNA的试剂盒。
技术介绍
由于革兰氏阳性菌的细胞壁相对较厚，与革兰氏阴性菌的细胞壁成分不同，给食源性致病菌检测领域带来比较大的困难，严重影响了检测效率。传统提取革兰氏阳性菌基因组的方法中，酶解法是最常用的方法。酶解法需要用酶来消化革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖成分，然后用溶剂抽提，如酚/氯仿。吸附DNA材料主要采用硅质材料、阴离子交换树脂及磁珠等。该方法试剂耗材价格昂贵，成本较高。且步骤多、费时，操作过程中易产生蛋白酶残留，导致PCR反应受到抑制；酚、氯仿等有机溶剂易造成环境污染，有损实验操作者的健康。当仅有少量材料时，传统的DNA制备方法格外不适用。其他方法，如超声波法、研磨法、冻融法都能够帮助破除革兰氏阳性菌的细胞壁，但是由于操作复杂度、特殊仪器等方面的限制原因，没能够在食源性致病菌检测领域扩大使用，长期以来，革兰氏阳性菌样本中DNA的提取和纯化一直是耗时、繁琐的过程，严重减慢了检测速度，低通量的提取方法已经无法满足大量样本制备基因组DNA的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服目前的DNA提取方法在用于革兰氏阳性细菌基因组DNA提取时所存在的效率较低的缺陷，提供一种以较高提取效率分离纯化出高收率和高纯度的革兰氏阳性细菌基因组DNA的试剂盒和方法。为了实现上述目的，本专利技术首先提供一种提取革兰氏阳性菌基因组DNA的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：粒径为78μm-106μm的第一玻璃珠和粒径为425-600μm的第二玻璃珠，且所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠在使用时的重量比为1：(0.6-1.3)。优选的，所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠在使用时的重量比为1：(0.8-1.2)。本专利技术还提供了一种革兰氏阳性菌基因组DNA提取方法，其中，该方法包括以下步骤：(1)将菌体与DNA纯化缓冲液、粒径为78μm-106μm的第一玻璃珠和粒径为425-600μm的第二玻璃珠混合得到裂解混合物；其中，所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠的重量比为1：(0.6-1.3)；(2)对所述裂解混合物进行脉冲震荡裂解，脉冲震荡裂解的条件为在5000-7000rpm下进行3-5次脉冲震荡，每次脉冲震荡2-4s，每次间歇1-3s获得裂解产物；(3)将所述裂解产物在80-100℃下孵育2-10min后冷却至15-25℃，离心后得到上清液。本专利技术还提供了所述试剂盒或提取方法在革兰氏阳性菌检测中的用途。通过上述技术方案，本专利技术能够实现革兰氏阳性菌基因组快速提取，克服了传统基因组提取方法上的不足之处，具备如下有益效果：(1)简便快速易操作：提取方法操作步骤少，操作简单，整个过程仅需要10分钟就可以完成。(2)提取通量高，样品需求少：可以一次性提取100个样本，检测样本可以是培养皿上的单菌落菌体或增菌液。(3)适用菌体范围广泛：采用不同粒径的玻璃珠进行组合，可以适用不同直径大小的食源性革兰氏阳性菌，提取效果可靠、高效。(4)成本低、安全可靠：不需要特殊仪器、昂贵试剂、无有毒有害物质，安全性高。本专利技术的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。附图说明附图是用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本专利技术，但并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1是四种革兰氏阳性菌基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果。其中，泳道1：金黄色葡萄球菌；泳道2：蜡样芽孢杆菌；泳道3：单增李斯特菌；泳道4：链球菌；泳道5：空白对照；M：5KMarker；图2是金黄色葡萄球菌基因组DNA的荧光定量结果；其中，A为商品化试剂盒(天根生物，DP302)提取的基因组DNA的荧光定量结果；B为用本专利技术试剂盒提取的基因组DNA的荧光定量结果；具体实施方式以下结合附图对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。本专利技术提供了一种提取革兰氏阳性菌基因组DNA的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：粒径为78μm-106μm的第一玻璃珠和粒径为425-600μm的第二玻璃珠，且所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠在使用时的重量比为1：(0.6-1.3)。其中，本专利技术采用的粒径为78μm-106μm的第一玻璃珠和粒径为425-600μm的第二玻璃珠混合，二者直径大小差异大，可以破碎较小(0.2μm)和较大(3μm)的细菌菌体，将二者混合使用效果明显优于单一粒径玻璃珠的破壁效果，特别适用于革兰氏阳性菌的破壁；不仅避免了由于破壁不完全造成的漏提漏检，而且显著节省了实验操作时间。其中，根据本专利技术一种优选的实施方式，所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠在使用时的重量比为1：(0.8-1.2)。在该优选实施方式中，本专利技术能够进一步提高样本中基因组DNA的收率和纯度。其中，所述试剂盒还含有DNA纯化缓冲液，所述DNA纯化缓冲液含有11-13％(m/v)的Chelex-100和5-15mMTris，且pH值为8.8-9.2。玻璃珠振荡破壁后细胞内容物释放到液体环境中，由于细胞内容物含有大量蛋白、糖类、以及盐离子等，这些因素会影响提取的基因组DNA的质量并进而影响下游应用的效果，例如，能够抑制PCR反应。为了能够快速的纯化DNA以满足下游应用特别是PCR反应的质量要求，本专利技术的技术方案采用Chelex-100和Tris的碱性溶液来纯化DNA。本专利技术所提供的试剂盒中，DNA纯化缓冲液在一定条件下可以导致细胞膜破裂和DNA变性，使DNA释放出来，通过高选择性地结合多价阳离子，可阻止金属离子对DNA降解的催化作用，并能去除肽类等可与DNA结合的大分子物质。进而可以快速有效的去除大多数的阳性离子，沉降大部分的蛋白，有效保护DNA。以免影响下一步的应用。所述DNA纯化缓冲液可以通过以下方法配置：用电子天平称取Chelex-100，将Chelex-100颗粒加入到无菌水中；加入1MTris(pH值为9)，定容至100ml；本专利技术还提供了一种革兰氏阳性菌基因组DNA提取方法，其中，该方法包括以下步骤：(1)将菌体与DNA纯化缓冲液、粒径为78μm-106μm的第一玻璃珠和粒径为425-600μm的第二玻璃珠混合得到裂解混合物；其中，所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠的重量比为1：(0.6-1.3)；(2)对所述裂解混合物进行脉冲震荡裂解，脉冲震荡裂解的条件为在5000-7000rpm下进行3-5次脉冲震荡，每次脉冲震荡2-4s，每次间歇1-3s获得裂解产物；(3)将所述裂解产物在80-100℃下孵育2-10min后冷却至15-25℃，离心后得到上清液。其中，所述DNA纯化缓冲液含有11-13％(m/v)的Chelex-100和5-15mMTris，且pH值为8.8-9.2。在本专利技术的一种实施方式中，所述菌体从菌液中分离得到，可以先将含有菌体的菌液离心分离得到菌体，再按照本专利技术所提供的方法进行基因组DNA提取。其中，在步骤(1)中可以将菌体与DNA纯化缓冲液充分混合后再加入所述第一玻璃珠和第二玻璃珠。其中，根据本专利技术一种优选的实施方式，所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠在使用时的重量比为1：(0.8-1.2)。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提取革兰氏阳性菌基因组DNA的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：粒径为78μm‑106μm的第一玻璃珠和粒径为425‑600μm的第二玻璃珠，且所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠在使用时的重量比为1：(0.6‑1.3)。

【技术特征摘要】
1.一种提取革兰氏阳性菌基因组DNA的试剂盒，其中，所述试剂盒包括：粒径为78μm-106μm的第一玻璃珠和粒径为425-600μm的第二玻璃珠，且所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠在使用时的重量比为1：(0.6-1.3)。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠在使用时的重量比为1：(0.8-1.2)。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还含有DNA纯化缓冲液，所述DNA纯化缓冲液含有11-13％的Chelex-100和5-15mMTris，且pH值为8.8-9.2。4.一种革兰氏阳性菌基因组DNA提取方法，其中，该方法包括以下步骤：(1)将菌体与DNA纯化缓冲液、粒径为78μm-106μm的第一玻璃珠和粒径为425-600μm的第二玻璃珠混合得到裂解混合物；其中，所述第一玻璃珠与所述第二玻璃珠的重量比为1：(0.6-1.3)；(2)对所述裂解混合物进行脉冲震荡裂...

【专利技术属性】
技术研发人员：王雷，刘晓东，王晓艳，张志强，
申请(专利权)人：北京卓诚惠生生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11