结合转化生长因子α且对Ras基因突变的癌具有增殖抑制活性的抗体制造技术

本发明专利技术发现了在显示与天然型TGFα的反应性的抗体中，与G79A置换型TGFα的反应性低的抗体对Ras基因中具有突变的癌细胞具有优异的增殖抑制效果。本发明专利技术进一步发现了，这些抗体中的很多抗体也具有抑制EGFR的酪氨酸磷酸化的活性和/或抑制引诱血管内皮细胞的活性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及结合转化生长因子a (Transforming growth factor alpha,以下称为“TGFa ”)、并具有在体内抑制Ras蛋白质具有突变的癌细胞增殖的效果的单克隆抗体，以及含有该抗体的抗癌剂。
技术介绍
TGFa是1980年初期由Spawn ( ^ — )和Roberts (罗伯茨)等的小组，自小鼠肉瘤病毒转化的小鼠3T3细胞的培养上清中，作为对于软琼脂中诱导正常大鼠肾脏成纤维细胞(NRK细胞)集落形成所必要的2种因子之一而分离、精制的(非专利文献1-6)。·TGFa作为由160个氨基酸组成的前体多肽生物合成，在细胞内糖链修饰以及棕榈酰化后，作为I型膜贯通蛋白质在细胞膜表面表达(膜型TGF a )(非专利文献7)。其后，细胞外结构域受到TACE/ADAM17等金属蛋白酶切断，由第40位至第89位的50个氨基酸(约6kDa)构成的单一多肽作为分泌型TGFa而游离(非专利文献8_10)。分泌型TGFa具有通过6个半胱氨酸残基于3个地方进行二硫键合的特征性结构(非专利文献11-13)。该结构最初在上皮细胞生长因子(epidermal growth factor, EGF)中发现，以后称为EGF样结构域。具有EGF样结构域的蛋白质，除了 TGFa和EGF之外，还有双调蛋白(amphiregulin) >HB-EGF> β -动物纤维素、上皮调节蛋白(epiregulin)、epigen、神经调节蛋白-1、神经调节蛋白-2、神经调节蛋白-3、神经调节蛋白-4、神经调节蛋白-5以及神经调节蛋白_6(以下将神经调节蛋白-1 -6称为神经调节蛋白)，共计存在13种具有EGF样结构域的蛋白质，这些总称为EGF家族分子(非专利文献10、非专利文献14)。EGF家族分子与TGFa同样，全部作为I型膜蛋白质生物合成，细胞外结构域通过蛋白酶分解而成为游离型(非专利文献10)。物种间的氨基酸同源性高，EGF样结构域构造也是保守的。例如，人与小鼠的TGFa氨基酸同源性为92%，人TGFa作用于小鼠或大鼠(非专利文献15)。EGF家族分子作为直接结合受体型酪氨酸激酶EGF受体(EGFR)家族(别名ErbB家族)的配体发挥作用。EGFR家族根据结构上的类似性目前鉴定为4种，分别称为EGFR(ErbBl)、HER2 (ErbB2)、HER3 (ErbB3)以及 HER4 (ErbB4)(非专利文献 14、16)。存在的13种EGF家族分子中，作为结合EGFR的配体已知有TGF a、EGF、双调蛋白、β -动物纤维素、上皮调节蛋白(epiregulin)等。神经调节蛋白结合HER3,神经调节蛋白，β-动物纤维素、HB-EGF结合HER4。HER2不具有配体结合部位(非专利文献14，16)。EGF家族分子结合作为受体的EGFR家族分子后，受体形成二聚体的同时，通过位于细胞内结构域的酪氨酸激酶诱导酪氨酸残基磷酸化(非专利文献16)。接着将细胞内各种各样的蛋白质以级联状进行活化。作为这样的级联途径的代表例，已知有Ras/Raf/MAPK途径、PI3K/Akt/mT0R途径以及JAK-STAT途径。Ras/Raf/MAPK途径主要参与细胞的增殖和生存，PI3K/Akt/mT0R途径参与细胞生长或抗程序性细胞死亡、细胞浸润、细胞游走等(非专利文献17)。向软琼脂中的大鼠正常成纤维细胞Rat-1添加分泌型TGFa时，Rat-1的细胞形态变化为转化细胞样，在琼脂中形成集落(非专利文献15)。另外，导入了 TGFa基因的CHO细胞也成为转化样细胞，移植至裸小鼠时容易形成肿瘤(非专利文献9)。可如下理解，此时CHO细胞表面上的EGFR通过有意地磷酸化，CHO分泌的TGF α自分泌性地诱导细胞增殖。作为TGFa的其他生理功能，已知有作为强力的血管新生诱导因子的功能。认为是通过TGFa作用于在血管内皮细胞表达的EGFR，诱导血管内皮细胞的游走和增殖(非专利文献 18-21)。健康正常人的TGFa的成体内分布特征是，在呼吸道上皮或大肠的粘膜上皮等的粘膜上皮细胞表达(非专利文献22-24)。该表达模式类似于EGFR的表达模式。另一方面，对于癌，以实体肿瘤为中心，广泛知道TGFa的过量表达(非专利文献22、23)。在头颈部癌、肺癌、乳癌、胃癌、大肠癌、肾脏癌、肝癌、卵巢癌、黑素瘤等各种各样的癌种类中确认在mRNA以及蛋白质水平上TGF α的表达增强。据报导，作为受体的EGFR也在各种癌组织中确认有过量表达，特别是在非小细胞肺癌或头颈部扁平上皮癌、肾癌中TGFa与EGFR的表达量正 相关(非专利文献25-29)。在实体瘤的周边部位由形成被称为间质的癌细胞立脚点的基质(stroma)(主要是成纤维细胞)和运送营养的血管所构成的组织发育。使用抗TGFa抗体进行癌组织的免疫组织染色的结果可知，TGFa不仅在癌部位存在，在间质也存在(非专利文献25、29)。由此认为TGFa不仅诱导癌细胞的自分泌性增殖，还通过作为支持癌生长的间质的生长因子发挥功能，有助于癌的恶性化(非专利文献18-21、30)。如上所述，含有TGF α的EGF家族分子或作为其受体的EGFR —定参与癌的增殖。因此，当然地期待将TGF α或EGFR作为靶标来控制癌细胞的增殖(非专利文献16_17、31)。1980年代初开始了将EGFR作为癌治疗靶标的单克隆抗体的研究(非专利文献32-34)。开发了与作为配体的EGF竞争结合、具有抑制EGFR的酪氨酸磷酸化、二聚体化的活性的单克隆抗体西妥昔单抗(cetuximab :商品名艾比特思(Erbitux))(非专利文献35、36)。西妥昔单抗抑制以A431细胞为首的培养癌细胞的增殖，确认在小鼠荷瘤模型中也发挥抗肿瘤效果，1990年以扁平上皮肺癌患者为对象开始了临床试验。在2001-2002年进行的随机比较临床试验中证明了对于大肠癌的效果，在2003年作为对于转移性大肠癌的治疗剂在瑞士开始受到认可。FDA也在2004年承认其作为对于表达EGFR的转移性大肠癌的治疗剂，在2006年追加承认其作为表达EGFR的头颈部癌的治疗剂。在日本于2008年作为EGFR阳性的不能治愈切除的进行性和/或再发性结肠直肠癌的治疗剂受到厚生劳动省的制造销售承认(非专利文献37)。作为同样与EGFR结合来抑制癌增殖的抗EGFR单克隆抗体已知有帕尼单抗(panitumumab)(品名Vectibix,安进公司(Amgen))(非专利文献38)。帕尼单抗(panitumumab)在欧美与西妥昔单抗同样地作为EGFR阳性的进行性和/或再发性大肠癌的治疗剂使用。任一抗EGFR封闭抗体都可改善化学疗法无效的大肠癌患者的总生存期间和无病情恶化生存期间，维持生活的质量，因此期望对于其他的EGFR阳性癌的适应扩大(非专利文献31、35、39)。但是，另一方面，西妥昔单抗抵抗性的大肠癌的频率高，50%以上的患者发现大肠癌的病情恶化(非专利文献40-41)。对于该西妥昔单抗抵抗性，指出与K-Ras基因突变相关。即，位于EGFR的下游的K-Ras的基因存在突变时，与西妥昔单抗或帕尼单抗(panitumumab)是否封闭了 EGFR无关,细胞活化,癌维持增殖(非专利本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.05.18 JP 2010-1144601.针对人TGFa的抗体，其是对Ras基因中具有突变的癌细胞显示增殖抑制活性的抗体。2.抗体，其是与79位的甘氨酸具有突变的人TGFa的反应性低于与天然型人TGFa的反应性的抗体。3.根据权利要求2所述的抗体，其中，79位的甘氨酸具有突变的人TGFa是G79A置换型的人TGF a。4.根据权利要求1 3任一项所述的抗体，其具有抑制EGFR的酪氨酸磷酸化的活性。5.根据权利要求1 4任一项所述的抗体，其具有抑制血管内皮细胞的诱导的活性。6.根据权利要求1所述的抗体，其具有下述(a) (h)的任一项所述的特征， (a)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号19 21所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号22 24所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列； (b)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号25 27所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号28 30所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列； (c)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号31 33所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号34 36所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列； (d)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号37 39所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号40 42所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列； (e)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号43 45所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号46 48所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列； (f)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号49 51所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号52 54所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列； (g)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号55 57所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号58 60所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列； (h)保持有轻链可变区和重链可变区，其中所述轻链可变区包含序列编号61 63所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列，所述重链可变区包含序列编号64 66所述的氨基酸序列、或者至少任一所述氨基酸序列中置换、缺失、添加和/或插入I个或多个氨基酸的氨基酸序列。7.根据权利要求1所述的抗体，其具有下述(a) (h)的任...

【专利技术属性】
技术研发人员：金田诚，藤井庆宏，早田芳弘，岸义朗，矢原一郎，
申请(专利权)人：株式会社医学生物学研究所，
类型：
国别省市：