在具有另外木糖异构酶活性的重组发酵单胞菌属中改善的木糖利用制造技术

据发现，表达来自密苏里游动放线菌的木糖异构酶的发酵单孢菌属在生长于包含木糖的培养基时具有改善的木糖利用、生长和乙醇生产。通过分子系统发生分析和序型隐蔽马尔科夫模型分析在结构上鉴定了与密苏里游动放线菌的木糖异构酶相关的木糖异构酶，从而提供了可用于改善木糖利用的木糖异构酶。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在具有另外木糖异构酶活性的重组发酵单胞菌属中改善的木糖利用本申请要求2010年6月29日提交的美国临时申请61/359463的权益，并且其全文以引用的方式并入。政府权利声明本专利技术由美国政府支持通过能源部(theDepartmentofEnergy)授予的合同No.DE-FC36-07GO17056而完成。美国政府拥有本专利技术的必然权利。专利
本专利技术涉及微生物学和基因工程领域。更具体地，鉴定了在发酵单胞菌属(Zymomonas)中具有高活性木糖异构酶，其提供了改善的木糖利用和乙醇生产。专利技术背景通过微生物生产乙醇提供了一种替代化石燃料的可供选择的能源，因此成为当前研究的重要领域。理想的情况是，产生乙醇以及其它有用产物的微生物能够利用木糖作为碳源，这是因为木糖是水解的木质纤维素生物质中的主要戊糖。生物质可提供丰富可用的低成本碳底物。已经对在天然情况下并不利用木糖的运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)和其它细菌乙醇菌原进行基因工程改造以用于木糖利用，其通过导入编码如下的基因：1)木糖异构酶，其催化木糖向木酮糖的转化；2)木酮糖激酶，它将木酮糖磷酸化以形成5-磷酸木酮糖；3)转酮醇酶；以及4)转醛醇酶。所使用的编码区一般来自大肠杆菌(E.coli)基因。对运动发酵单胞菌菌株进行木糖代谢的工程改造(US5514583，US5712133，US6566107，WO95/28476，Feldmann等人(1992)Appl.Microbiol.Biotechnol.，38：354-361，Zhang等人(1995)Science267：240-243)，以及对棕榈发酵杆菌(Zymobacterpalmae)菌株的工程改造(Yanase等人(2007)Appl.Environ.Mirobiol.73：2592-2599)已经获得成功。然而，工程化的菌株通常不像在葡萄糖上那样在木糖上生长并且产生乙醇。已经通过在木糖培养基上进行的连续传代而驯化了针对木糖利用进行工程改造的菌株，其产生了具有改善的木糖利用的菌株，如美国专利7,223,575和美国专利7,741,119中所描述。在共同拥有并共同待决的美国专利申请公开US20090246846A1中公开了通过以来自突变的高活性运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子(Pgap)进行的大肠杆菌木糖异构酶表达而改善木糖利用的工程改造。依然需要对于在木糖利用中具有进一步改善的发酵单胞菌属菌株和其它细菌乙醇菌原。专利技术概述本专利技术提供了表达高活性木糖异构酶的重组木糖利用型发酵单胞菌属或发酵杆菌属(Zymobacter)细胞，其提供了改善的木糖利用和乙醇生产。因此，本专利技术提供了选自发酵单胞菌属和发酵杆菌属的重组细菌菌株，其包含编码具有木糖异构酶活性的多肽的异源核酸分子，其中所述多肽是组I木糖异构酶且被包括在标识为EC5.3.1.5的酶的分类中，并且所述菌株利用木糖作为碳源。可用于本专利技术的木糖异构酶是当使用利用SEQIDNO：2、24、32、34、42、54、66、68、78、96、100、106、108、122、126、128、130、132、135、137和142准备的序型隐蔽马尔科夫模型(ProfileHiddenMarkovModel)查询时，给出1E-15或更低的E值得分的酶；所述查询使用hmmsearch算法进行，其中Z参数设定为10亿。或是基于使用GAPPENALTY＝10、GAPLENGTHPENALTY＝0.1、以及Gonnet250系列的蛋白质权重矩阵的默认参数的ClustalW比对方法，与选自SEQIDNO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146和147的氨基酸序列具有至少90％的同一性的酶。或当与SEQIDNO：66的参照氨基酸序列比较时具有以下保守氨基酸或以下保守氨基酸的90％的酶：a)在位置226处的亮氨酸，b)在位置223处的甲硫氨酸，c)在位置191处的异亮氨酸，d)在位置195处的苏氨酸、丝氨酸或缬氨酸，e)在位置88处的甲硫氨酸、苏氨酸或quaninef)在位置290处的组氨酸，g)在位置221处的谷氨酸或天冬氨酸，h)在位置242处的苯丙氨酸、缬氨酸或亮氨酸，i)在位置243处的组氨酸，j)在位置193处的亮氨酸、苯丙氨酸或甲硫氨酸，k)在位置256处的谷氨酰胺，l)在位置213处的甘氨酸，m)在位置288处的脯氨酸、酪氨酸、丙氨酸或丝氨酸，和n)在位置249处的谷氨酰胺。在另一个实施方案中，本专利技术提供了改善重组细菌细胞中木糖利用的方法，其包括：a)提供选自发酵单胞菌属和发酵杆菌属的重组细菌菌株，所述重组细菌菌株包含木糖利用途径，包含不属于组I的木糖异构酶；以及b)导入编码具有木糖异构酶活性的多肽的异源核酸分子，其中所述多肽是组I木糖异构酶。或者，本专利技术提供了生产乙醇的方法，其包括：a)提供本专利技术的重组细菌菌株；以及b)在所述菌株生产乙醇的条件下，使(a)的菌株与木糖接触。附图说明和序列描述图1示出了进行木糖利用工程改造的发酵单胞菌属的乙醇发酵途径的示意图。图2是木糖异构酶的系统发育树的示意图，其显示了组I和组II分支。图3是组I木糖异构酶的系统发育树的示意图。图4是ZW641对照菌株和使用具有表达来自密苏里游动放线菌(A.missourinesis)(355-1、355-2)、短乳杆菌(L.brevis)(356-1、356-2)或大肠杆菌(357-1、357-2)的木糖异构酶的密码子优化编码区的基因进行转化的ZW641菌株的生长曲线图。图5是ZW641对照菌株和使用具有表达来自密苏里游动放线菌(355-1)、短乳杆菌(356-2)或大肠杆菌(357-2)的木糖异构酶的密码子优化编码区的基因进行转化的ZW641菌株的木糖异构酶活性图，其通过半胱氨酸-咔唑法进行测量。图6是ZW641对照菌株和使用具有表达来自密苏里游动放线菌(AMxylA)、大肠杆菌(ECxylA)、昏暗地嗜皮菌(Geodermatophilusobscurus)(GOxylA)、耻垢分枝杆菌(Mycobacteriumsmegmatis)(MSxylA)、Salinisporaarenicola(SAxylA)或Xylanimonascellulosilytica(XCxylA)的木糖异构酶的密码子优化编码区的基因进行转化的ZW641菌株的生长曲线图。图7是ZW641对照菌株和使用具有表达来自密苏里游动放线菌(AMxylA)、大肠杆菌(ECxylA)、昏暗地嗜皮菌(GOxylA)、耻垢分枝杆菌(MSxylA)、Salinisporaarenicola(SAxy本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.06.29 US 61/3594631.选自发酵单胞菌属(Zymomonas)和发酵杆菌属(Zymobacter)的重组细菌菌株，其中所述菌株包含木酮糖激酶、转酮醇酶和转醛醇酶，并且进一步包含SEQIDNO:308所示的异源核酸分子，其中所述菌株利用木糖作为碳源，并且其中所述重组细菌菌株产生的乙醇量超过不包含所述异源核酸分子的对应的亲本菌株产生的乙醇量的3.5倍。2.改善重组细菌细胞中木糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：RY卡塞，M齐，L陶，PV维塔宁，J杨，
申请(专利权)人：纳幕尔杜邦公司，
类型：
国别省市：