田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白还原酶分子及其基因和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白还原酶分子的氨基酸序列。本发明专利技术还公开了田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白还原酶分子基因，包含编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。本发明专利技术田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白还原酶分子，对DTNB、胰岛素、底物BmiTrx和直系同源蛋白EcoTrx都具有良好的还原活性，适用于筛选治疗巴贝斯虫病的BmiTrxR抑制剂药物。

Vole, BABEI, thioredoxin reductase, molecules, genes and uses thereof

The present invention discloses an amino acid sequence of a vole, a BABEI, and a thioredoxin reductase molecule. The invention also discloses a vole BABEI worm thioredoxin reductase gene, containing a nucleotide sequence encoding SEQ ID NO.1 of amino acid sequence shown. The present invention vole BABEI insect thioredoxin reductase molecules, DTNB, insulin, BmiTrx and substrate orthologue EcoTrx has good reduction activity, suitable for screening, treatment of BABEI worm disease BmiTrxR inhibitor drug.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程
，尤其涉及一种田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白还原酶分子及其基因和应用。
技术介绍
田鼠巴贝斯虫(Babesiamicroti)是一种新发的、经蜱传播的人兽共患原虫病，寄生在人和啮齿动物宿主红细胞中，引起发热、贫血、全身衰竭等症状，年老者、摘除脾脏或免疫力低下的患者的感染最为严重，可导致死亡。自1969年美国加利福尼亚州检测到首例人感染田鼠巴贝斯虫至今，已经有数千例人感染报道，并且近年有升高的趋势。田鼠巴贝斯虫病主要流行于美国和欧洲部分国家，在世界其他地方都有报道，如日本、韩国、南非、巴西、印度等国和中国台湾；在中国大陆，人感染田鼠巴贝斯虫的病例也不断有报道，1982年李金福等在云南首次报道了两例疑似病例，1996年石珍宝等报道了一例来自内蒙古锡林浩特的疑似感染病例，2012年，中国浙江省疾病预防控制中心通过血涂片观察和核酸检测两种方法确诊一名中年女患者感染了田鼠巴贝斯虫。田鼠巴贝斯虫经媒介硬蜱叮咬传播，也可以通过临床输血途径传播，随着诊断技术的发展，更多的田鼠巴贝斯虫感染的病例可能会被发现。治疗是这种新发疾病面临的直接问题，目前只有少数药物用于临床，效果不够稳定，需要联合用药，新药研发十分迫切。在哺乳动物体内，巴贝斯虫在红细胞中繁殖，因此它需要抵御活性氧(ROS)或活性氮(RNS)的毒性作用，因为这两类物质主要会引起虫体DNA的氧化损伤和脂质过氧化。因此，为了抵御氧化压力，寄生虫利用硫氧还蛋白系统(Trx)来维持氧化还原平衡。这个系统包括NADPH、Trx和NADPH依赖的硫氧还蛋白还原酶(TrxR)。TrxR属于二聚体黄素酶家族，能够催化电子通过FAD结构域从NADPH转移给底物二硫化物。原虫TrxR的C末端氧化还原中心由四个氨基酸分隔的两个半胱氨酸残基构成，这一点区别于人的TrxR，因为后者是由硒代半胱氨酸代替的。一直以来，恶性疟原虫的Trx系统的研究较为广泛，但是在田鼠巴贝斯虫中的研究至今还没有报道，因此，为了找到药物靶标，需要研究田鼠巴贝斯虫TrxR的特点，以便针对药物靶标设计合理的抑制剂。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白还原酶分子及其基因，该田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白还原酶分子可用于制备治疗巴贝斯虫病的药物。为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现:在本专利技术的一个方面，提供了一种田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白还原酶分子，其氨基酸序列选自：(1)SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；(2)SEQIDNO.1所示氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代一个或多个氨基酸所得到的具有硫氧还蛋白还原酶活性，且与SEQIDNO.1具有95％以上同源性的氨基酸序列。优选的，所述田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白还原酶分子的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的另一方面，提供了一种田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白还原酶分子基因，其包含：编码SEQIDNO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。优选的，所述田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白还原酶分子基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。在本专利技术的另一方面，还提供了一种重组载体，包含上述田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白还原酶分子基因序列或其部分序列。所述重组载体包括重组克隆载体或重组表达载体。在本专利技术的另一方面，还提供了一种包含上述重组载体的宿主细胞。在本专利技术的另一方面，还提供了一种田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白还原酶分子重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：构建含上述田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白还原酶分子基因的重组表达载体；将所述重组表达载体转化入大肠杆菌宿主细胞；培养包含重组表达载体的大肠杆菌宿主细胞，并在合适条件下，诱导该重组表达载体表达田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白还原酶分子重组蛋白。在本专利技术的另一方面，还提供了一种上述田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白还原酶分子的应用，用于筛选治疗巴贝斯虫病的药物。所述药物为田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白还原酶的抑制剂。在本专利技术的另一方面，还提供了一种上述田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白还原酶分子的应用，用于制备二硫化物还原酶制剂。本专利技术田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白还原酶分子，经重组表达获得的重组蛋白BmiTrxR，由酶活动力学分析实验表明具有很好的DTNB和胰岛素还原活性，对于底物BmiTrx和直系同源蛋白E.coli(EcoTrx)也具有还原活性，适于筛选治疗巴贝斯虫病的BmiTrxR抑制剂药物。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细的说明。图1是本专利技术实施例1的BmiTrxR基因与其他物种TrxR的氨基酸序列比对图；图2是本专利技术实施例2的重组蛋白BmiTrxR的表达与纯化结果图；图3是本专利技术实施例3的WesternBlotting检测结果图；图4是本专利技术实施例5的不同pH条件下重组蛋白BmiTrxR的DTNB还原酶活性结果图；图5是本专利技术实施例5的在DTNB还原酶活性试验中，不同浓度下的重组蛋白BmiTrxR的酶活反应初速度图；图6是本专利技术实施例5的重组蛋白BmiTrxR和大鼠TrxR(RatTrxR)的DTNB还原酶活性对比图；图7是本专利技术实施例5的Trx还原试验结果图；图8是本专利技术实施例5的金诺芬作为重组酶BmiTrxR的二硫化物还原酶抑制剂试验结果图。具体实施方式下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂，汪嘉玺，朱厚础，等译.第3版，北京：科学出版社，2002)中所述的方法进行。本专利技术首次从田鼠巴贝斯虫虫体裂殖子中获得一个新的硫氧还蛋白还原酶分子，简称BmiTrxR，将其基因编码区克隆到表达载体，在大肠杆菌中进行重组表达，由酶活动力学实验分析BmiTrxR重组蛋白对DTNB和胰岛素还原活性，以及对底物BmiTrx和直系同源蛋白E.coli(EcoTrx)的还原活性。实施例1田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白还原酶分子(BmiTrxR)的基因克隆和序列分析1.材料与方法1.1.寄生虫田鼠巴贝斯虫引自美国标准菌库(ATCC)，编号ATCCRPRA-99TM，在本实验室经过昆明系小鼠体内接种传代保存。1.2.细菌与质粒质粒构建及蛋白表达用到的是大肠杆菌Top10细胞(Invitrogen)和大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)。克隆测序载体用到的是pGEM-TEasy(Promega)，表达载体用的是pET28avector(Novagen)。1.3.田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白还原酶(B.microtiTrxR)的分子克隆用TRIzolreagent(Invitrogen)提取虫体裂殖子的RNA，然后RNA经过DNaseⅠ(TOYOBO)的消化，去除其中的基因组DNA。通过反转录从虫体的总RNA中获得cDNA，整个步骤按照反转录试剂盒(TaKaRa,Dalian,China)说明书进行操作。BmiTrxR开放阅读框的扩增引物是F:5’-ATGATTCTTCGGGCTGGATT-3’(SEQIDNO.3)和R:5’-TCAACCACACTTGCCCCCAC-3’(SEQIDNO.4)，全长序列通过SMARTerRACEcDNA扩增试剂盒(Clintech,SanJose,CA,USA)获得。根据已获得的部分序列，设计特异性引物(5′端快速扩增GSP1:5’本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白还原酶分子，其氨基酸序列选自：(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；(2)SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代一个或多个氨基酸所得到的具有硫氧还蛋白还原酶活性，且与SEQ ID NO.1具有95％以上同源性的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白还原酶分子，其氨基酸序列选自：(1)SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；(2)SEQIDNO.1所示氨基酸序列中缺失、添加、插入或取代一个或多个氨基酸所得到的具有硫氧还蛋白还原酶活性，且与SEQIDNO.1具有95％以上同源性的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的硫氧还蛋白还原酶分子，其特征在于，所述田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白还原酶分子的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。3.一种田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白还原酶分子基因，其包含：编码SEQIDNO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。4.根据权利要求3所述的硫氧还蛋白还原酶分子基因，其特征在于，所述田鼠巴贝斯虫硫氧还蛋白还原酶分子基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。5.一种重组载体，其特征在于，包含：权利要求3所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：周金林，赵少若，龚海燕，张厚双，曹杰，周勇志，
申请(专利权)人：中国农业科学院上海兽医研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31